12月18日，國際學(xué)術(shù)期刊Circulation 在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組的科研成果“Fate Mapping of Sca1+ Cardiac Progenitor Cells in the Adult Mouse Hearts”。研究人員利用特異性標(biāo)記心臟Sca1+干細(xì)胞的Sca1-2A-CreER小鼠，揭示Sca1+心臟干細(xì)胞在正常生理和心臟損傷模型中能轉(zhuǎn)分化為心臟內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，不轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞。本研究揭示了Sca1+心臟干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化潛能，有助于研究人員進(jìn)一步深入了解成體心臟中Sca1+干細(xì)胞的作用，為心血管再生醫(yī)學(xué)研究提供新的思路。

該研究中Sca1-2A-CreER小鼠模型由南模生物構(gòu)建。

成體干細(xì)胞是可以自我更新的細(xì)胞，也可以分化為2種以上不同的細(xì)胞類型。成體干細(xì)胞似乎是人體組織再生的解決方案。成人干細(xì)胞可能從現(xiàn)有組織中分離出來（甚至可能組織活檢或血液樣本即可），然后獲得足夠數(shù)量的患者自己的分化細(xì)胞。無論感興趣的組織是什么，研究人員都希望識(shí)別并分離出該組織的內(nèi)源性成體干細(xì)胞。

冠狀動(dòng)脈疾病引起心肌梗死和心衰，是人類因疾病死亡的首要原因。發(fā)生急性心肌梗死后，心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞大量死亡，僅少量心肌細(xì)胞分裂增殖，如何提高心臟心肌細(xì)胞的再生已經(jīng)成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。前期研究表明在心臟中存在的心臟干細(xì)胞可以在損傷的情況下貢獻(xiàn)到心肌細(xì)胞，從而提高損傷心臟的修復(fù)能力。

Sca-1是Ly6蛋白超家族的成員。目前至少發(fā)現(xiàn)有35種人和61種小鼠Ly6蛋白。小鼠Sca-1細(xì)胞表面蛋白的功能尚不清楚，并且沒有明確的人類直系同源物。體外細(xì)胞和移植實(shí)驗(yàn)表明Sca1+心臟干細(xì)胞可以轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞，同時(shí)Sca1+作為血管干細(xì)胞可以通過增殖、分化轉(zhuǎn)變?yōu)檠軆?nèi)皮細(xì)胞。這些早前的研究說明Sca1+細(xì)胞具有多種分化潛能，但心臟中內(nèi)源性的Sca1+細(xì)胞是否作為成人心臟干細(xì)胞，能否貢獻(xiàn)到心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞仍有待于進(jìn)一步研究。

• 建立Sca1+譜系示蹤工具鼠Sca1-2A-CreER

利用CRISPR基因編輯技術(shù)，將2A自切割肽連同他莫昔芬誘導(dǎo)型Cre重組酶CreER定點(diǎn)敲入到小鼠內(nèi)源性Sca1的終止密碼子位置，建立Sca1-2A-CreER工具小鼠。該策略不會(huì)破壞內(nèi)源性Sca1蛋白的產(chǎn)生。

圖A.? Schematic figure showing the knockin strategy for generation of Sca1-2A-CreER allele.

• Sca1-2A-CreER特異和高效地標(biāo)記Sca1+心臟干細(xì)胞

將Sca1-2A-CreER小鼠與R26-LSL-tdTomato報(bào)告基因小鼠交配獲得Sca1-2A-CreER;R26-tdTomato小鼠?？勾萍に厮幬锼舴遥╰amoxifen）誘導(dǎo)處理24-48小時(shí)后，收集Sca1-2A-CreER;R26-tdTomato小鼠的心臟樣本。流式細(xì)胞分析和免疫染色數(shù)據(jù)顯示Sca1-2A-CreER特異性標(biāo)記小鼠心臟中的內(nèi)源性Sca1 +細(xì)胞（圖B-D）。

圖B-D. B, Immunostaining for Sca1 and tdTomato on Sca1-2A-CreER;R26-tdTomato heart section collected at 24 to 48 hours after tamoxifen induction. C, Quantification of the percentage of Sca1+ cells in tdTomato+ cells. D, Flow cytometric analysis of Sca1+ cells in tdTomato+ cells, showing specificity of Sca1+ cell labeling.

Z-stack confocal圖像顯示Sca1+細(xì)胞是VE-cad +細(xì)胞（圖E），因?yàn)榇蠖鄶?shù)（67.48±2.18％）VE-cad+內(nèi)皮細(xì)胞是tdTomato+的，而幾乎所有tdTomato+細(xì)胞（95.14±0.71％）是VE-cad+內(nèi)皮細(xì)胞。對(duì)tdTomato和TNNI3的免疫染色顯示Sca1-2A-CreER沒有標(biāo)記心肌細(xì)胞（圖F）。在分離出來的心肌細(xì)胞中也未發(fā)現(xiàn)任何tdTomato +細(xì)胞（圖G）。表明Sca1-2A-CreER可以特異和高效地標(biāo)記Sca1+心臟干細(xì)胞，其中主要標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞。

圖E-G.? E and F, Immunostaining for tdTomato and VE-cad (E) or TNNI3 (F) on heart sections. Arrowheads indicate tdTomato+ endothelial cells. YZ indicates signals from dotted lines on Z-stack images. G, Bright-field and epifluorescence images of dissociated cardiomyocytes.

• 利用Sca1-2A-CreER小鼠研究Sca1+心臟干細(xì)胞在正常生理情況下的命運(yùn)變化

對(duì)8周齡的Sca1-2A-CreER;R26-tdTomato小鼠注射他莫昔芬，收集注射后1-12周小鼠心臟樣本。對(duì)tdTomato和TNNI3染色的Z-stack confocal圖像、流式細(xì)胞術(shù)分析、以及分離心肌細(xì)胞結(jié)果均顯示并沒有發(fā)現(xiàn)tdTomato+心肌細(xì)胞（圖H-J）。相比之下，流式細(xì)胞分析顯示60.88±2.38％的內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)tdTomato（圖K）。值得注意的是，94.25±0.54％的tdTomato +細(xì)胞是CD31 +內(nèi)皮細(xì)胞（圖K），表明大多數(shù)Sca1 +細(xì)胞在心臟穩(wěn)態(tài)期間采用內(nèi)皮細(xì)胞命運(yùn)。tdTomato和CD31的免疫染色顯示Sca1+細(xì)胞對(duì)大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞有貢獻(xiàn)（圖L）。Sca1+細(xì)胞也有助于心臟成纖維細(xì)胞。流式細(xì)胞和Z-stack confocal圖像分析顯示，不到2％的PDGFRα+細(xì)胞被tdTomato標(biāo)記，而不到0.6％的tdTomato+細(xì)胞表達(dá)PDGFRα（圖M和N）。說明在穩(wěn)態(tài)心臟中，Sca1+心臟干細(xì)胞可以貢獻(xiàn)到心臟內(nèi)皮細(xì)胞和少量的成纖維細(xì)胞，但并不能轉(zhuǎn)分化心肌細(xì)胞。

圖H-N.? Fate mapping of Sca1+ cells during cardiac homeostasis at 12 weeks after tamoxifen induction.

• 利用Sca1-2A-CreER小鼠研究Sca1+心臟干細(xì)胞在心臟損傷情況下的命運(yùn)變化

在他莫昔芬治療后2周進(jìn)行心肌梗塞（MI）模型，并在MI后第1、4和6周收集心臟。對(duì)tdTomato和TNNI3染色的Z-stack confocal圖像顯示MI心臟中沒有發(fā)現(xiàn)任何tdTomato+心肌細(xì)胞（圖O-P）。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示沒有tdTomato +心肌細(xì)胞（圖Q）。分離心肌細(xì)胞也沒有發(fā)現(xiàn)tdTomato +心肌細(xì)胞（圖R）。通過對(duì)MI心臟切片上的tdTomato和VE-cad進(jìn)行免疫染色，在受損區(qū)域檢測(cè)到大量tdTomato+冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（圖S）。在MI心臟的梗塞和邊界區(qū)域中檢測(cè)到PDGFRα+ tdTomato +細(xì)胞（圖T-V）。在缺血再灌注模型中，Sca1 +細(xì)胞也對(duì)心臟內(nèi)皮細(xì)胞有貢獻(xiàn)，但對(duì)心肌細(xì)胞沒有貢獻(xiàn)（圖W和X）。這些結(jié)果說明在心臟損傷模型中，Sca1+心臟干細(xì)胞可以貢獻(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，而并不轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞。

圖O-X. Fate mapping of Sca1+ cells after heart injuries.

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，成體Sca1+心臟干細(xì)胞具有轉(zhuǎn)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的潛能，通過血管新生促進(jìn)心臟修復(fù)（圖Y）。

圖Y.? Schematic figure showing Sca1+ cell fate in the adult heart.

這期Circulation雜志還同期刊發(fā)了另外4項(xiàng)關(guān)于Sca1+干細(xì)胞的研究。

• Neidig等人將他莫昔芬誘導(dǎo)型MerCreMer敲入到小鼠Sca1基因起始密碼子位置，通過用他莫昔芬打開重組酶并標(biāo)記Sca1+細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Sca1 +細(xì)胞變成內(nèi)皮細(xì)胞，很少有心肌細(xì)胞標(biāo)記；

• Vagnozzi等人使用組成型Sca1-Cre和誘導(dǎo)型Sca1-MerCreMer發(fā)現(xiàn)Sca1+細(xì)胞在整個(gè)發(fā)育期間，衰老期間和損傷后都會(huì)產(chǎn)生心臟血管系統(tǒng)，對(duì)心肌細(xì)胞群有很小的貢獻(xiàn)；

• Zhang等人設(shè)計(jì)了一系列重組酶以及熒光報(bào)告基因小鼠，以識(shí)別和跟蹤心臟中的Sca1 +細(xì)胞;他們發(fā)現(xiàn)Sca1 +細(xì)胞只是內(nèi)皮細(xì)胞譜系的；

• Soonpaa等人研究分離了GFP+小鼠的Sca1 +細(xì)胞并用第二個(gè)報(bào)告基因標(biāo)記心肌細(xì)胞核，這樣能夠?qū)ca1 +細(xì)胞移植到受損的心臟細(xì)胞中，并確定細(xì)胞是否成為心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的Sca1 +細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生心肌細(xì)胞。

• 利用不同的技術(shù)和研究策略，這5項(xiàng)研究均表明，心臟中的Sca1 +細(xì)胞很少成為心肌細(xì)胞，而Sca1 +心臟細(xì)胞的主要命運(yùn)是成為內(nèi)皮細(xì)胞（如下圖所示）。

圖Z. Significant numbers of cardiomyocytes do not arise from Sca-1+ cells. (Circulation. 2018;138:2940–2942)