1月15日，國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊《Immunity》在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所陳劍峰研究團(tuán)隊(duì)的最新研究成果“Fever Promotes T Lymphocyte Trafficking via a Thermal Sensory Pathway Involving Heat Shock Protein 90 and α4 Integrins”。該工作揭示了發(fā)熱促進(jìn)免疫細(xì)胞遷移的分子機(jī)制，以及該機(jī)制在機(jī)體免疫調(diào)控中的重要功能。

南模生物為該研究構(gòu)建了Itga4點(diǎn)突變小鼠模型。

• α4整合素

在炎癥與癌癥的病理過程中, 淋巴細(xì)胞與癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)是其中的關(guān)鍵步驟。而決定這些細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的一類重要分子是細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecule, CAM), 其中, 整合素(integrin)家族是最重要的一類黏附分子。整合素是一種跨膜的異質(zhì)二聚體，作為跨膜接頭在細(xì)胞外基質(zhì)之間起著雙向聯(lián)絡(luò)作用和細(xì)胞粘著作用，參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞的許多行為產(chǎn)生影響。在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的過程中, 整合素的功能受到動(dòng)態(tài)的、精確的調(diào)控。而病理?xiàng)l件下的整合素功能會(huì)發(fā)生紊亂。

α4整合素主要包含兩種分子, 分別是α4β1（又稱VLA-4，由?Itga4?基因編碼）和α4β7。其中, 整合素α4β1主要結(jié)合配體為血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1), 主要表達(dá)在炎癥部位HEVs樣的血管內(nèi)皮表面, 并且受細(xì)胞因子誘導(dǎo)表達(dá); 而整合素α4β7主要結(jié)合配體為PP結(jié)(Peyer’s patches, PP)和腸系膜淋巴結(jié)等HEVs上表達(dá)的黏膜地址素細(xì)胞黏附分子-1(mucosal addressin cell adhesion molecule-1, MAdCAM-1)。

α4整合素可以同時(shí)介導(dǎo)淋巴細(xì)胞的滾動(dòng)黏附和穩(wěn)定黏附, 使它在機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)維持中處于非常重要的位置。淋巴細(xì)胞在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的穩(wěn)定黏附是其跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移的先決條件, 所以類似于整合素LFA-1, α4整合素同樣能夠介導(dǎo)淋巴細(xì)胞在HEVs上跨內(nèi)皮細(xì)胞遷移。

• 熱休克蛋白90（heat shock protein 90，Hsp90）

熱休克蛋白是細(xì)胞在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的一類蛋白, 幾乎在所有生物中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn), 發(fā)熱所產(chǎn)生的高溫脅迫可以激活熱休克反應(yīng), 不但可以誘導(dǎo)宿主細(xì)胞內(nèi)起保護(hù)作用的熱休克蛋白表達(dá), 同時(shí)也可以誘導(dǎo)病原體內(nèi)熱休克蛋白激活宿主免疫防御。

• 發(fā)熱促進(jìn)α4整合素介導(dǎo)的T細(xì)胞粘附和遷移

圖1.?熱應(yīng)激對(duì)整合素介導(dǎo)的T細(xì)胞粘附和遷移的影響。野生型小鼠脾臟T細(xì)胞在體外分別用正常體溫（37℃）和發(fā)熱溫度（40℃）在含有或不含100ng/mL PTX的培養(yǎng)基中預(yù)處理12小時(shí)。PS/2為a4-blocking antibody；DATK32為a4b7-blocking antibody；2E6為b2-blocking-antibody。圖B-C可見發(fā)熱溫度（40℃）特異性促進(jìn)了α4整合素介導(dǎo)的T細(xì)胞粘附和遷移。

• Hsp90與α4尾部結(jié)合并通過?inside-out?信號(hào)激活α4整合素

發(fā)熱溫度（40℃）處理的T細(xì)胞中Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40和Hsp10表達(dá)上調(diào)，免疫共沉淀結(jié)果顯示Hsp90AA1和Hsp90AB1（Hsp90的兩種同種型）選擇性結(jié)合α4。在T細(xì)胞中過表達(dá)Hsp90，Hsp90-α4結(jié)合顯著增強(qiáng)；促進(jìn)了α4整合素介導(dǎo)的T細(xì)胞與VCAM-1和MAdCAM-1底物的粘附和遷移。

圖2.?熱應(yīng)激上調(diào)Hsp90的表達(dá)并促進(jìn)其與T細(xì)胞中α4整合素的結(jié)合。

Hsp90與α4之間究竟是通過哪些結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵位點(diǎn)相互結(jié)合的呢？利用不同亞基整合素尾部模型蛋白和Hsp90不同結(jié)構(gòu)域與HA-tag的融合表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Hsp90的N-末端結(jié)構(gòu)域（NTD）和C-末端結(jié)構(gòu)域（CTD）都直接并僅與α4亞基結(jié)合。進(jìn)一步確定Hsp90與α4尾部的ENRRDSWSY基序結(jié)合。將ENRRDSWSY基序中的9個(gè)殘基中的每一個(gè)單獨(dú)突變?yōu)楸彼?，結(jié)果發(fā)現(xiàn) R985A、W989A和Y991A 這三個(gè)突變消除了Hsp90與α4細(xì)胞質(zhì)尾部的結(jié)合，表明R985，W989和Y991是Hsp90與α4整合素結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。

圖3.??Hsp90通過α4細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的短序列與α4整合素結(jié)合。

圖4.?Hsp90的N和C末端與α4亞基結(jié)合。

利用α4整合素基因Itga4^R985A/R985A點(diǎn)突變小鼠模型（南模生物構(gòu)建），消除體內(nèi)Hsp90-α4的相互作用，也導(dǎo)致T細(xì)胞不能粘附和遷移，表明Hsp90-α4結(jié)合對(duì)于發(fā)熱誘導(dǎo)的α4整合素介導(dǎo)的T細(xì)胞粘附和遷移是必需的。此外，點(diǎn)突變小鼠中Hsp90-α4整合素相互作用受阻，也導(dǎo)致熱應(yīng)激狀態(tài)下無法促進(jìn)T細(xì)胞黏附以及歸巢。說明Hsp90-α4整合素相互作用對(duì)于高內(nèi)皮小靜脈(high endothelial venules, HEVs)中熱應(yīng)激促進(jìn)的T細(xì)胞滯留以及淋巴結(jié)歸巢都是必需的。

圖5.??Hsp90-α4整合素結(jié)合對(duì)熱應(yīng)激誘導(dǎo)的T細(xì)胞粘附和遷移至關(guān)重要。

發(fā)熱狀態(tài)或過表達(dá)Hsp90都會(huì)導(dǎo)致VCAM-1和MAdCAM-1與野生型T細(xì)胞的結(jié)合增加，但對(duì)Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變的T細(xì)胞沒有作用。表明由熱應(yīng)激增強(qiáng)的α4整合素結(jié)合依賴于Hsp90-α4相互作用。通過FRET分析α4胞外延伸域相對(duì)于質(zhì)膜的方向，發(fā)現(xiàn)發(fā)熱或過表達(dá)Hsp90后，野生型T細(xì)胞中的FRET效率降低，而Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變T細(xì)胞不受影響。表明熱應(yīng)激誘導(dǎo)的α4的延伸依賴于Hsp90-α4相互作用。免疫共沉淀結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，Hsp90與α4的結(jié)合是通過增強(qiáng)talin和kindlin-3這兩種關(guān)鍵整合素共激活因子的結(jié)合來觸發(fā)α4整聯(lián)蛋白?inside-out 激活的。

圖6.??Hsp90與α4的結(jié)合誘導(dǎo)α4整合素的活化。

• Hsp90觸發(fā)α4整合素的二聚化和聚類以激活FAK-RhoA

通過將綠色熒光蛋白（GFP）的兩個(gè)互補(bǔ)部分，GFP S1-10和GFP S11，融合到α4的C末端，建立了雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）系統(tǒng)。如果α4以二聚化的形式與Hsp90結(jié)合，那么就可以誘導(dǎo)出功能性GFP的表達(dá)。結(jié)果表明，每個(gè)Hsp90分子都同時(shí)與兩個(gè)α4整合素分子結(jié)合這使整合素更接近，在T細(xì)胞的外膜上形成它們的簇。并且發(fā)熱狀態(tài)下野生型T細(xì)胞膜上的GFP信號(hào)增強(qiáng)，說明發(fā)熱能有效誘導(dǎo)α4二聚化。Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變的T細(xì)胞在發(fā)熱狀態(tài)下不能誘導(dǎo)GFP的表達(dá)，因此說明α4二聚化依賴于Hsp90-α4相互結(jié)合。

圖7.?Hsp90與α4的結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞膜上α4整合素的二聚化和聚集。

利用Hsp90不同結(jié)構(gòu)域組合的突變蛋白過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)缺失NTD或CTD都無法誘導(dǎo)α4整合素的二聚化，說明這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域都是α4整合素二聚化所必需的。

圖8.?Hsp90的NTD和CTD都是誘導(dǎo)α4整合素二聚化所必需的。

FAK和Rhofamily（RhoA、Rac1和Cdc42）是由整合素激活并促進(jìn)細(xì)胞遷移的關(guān)鍵信號(hào)分子。正常T細(xì)胞中，發(fā)熱會(huì)上調(diào)FAK-Tyr397的磷酸化并誘導(dǎo)RhoA的活化。而在Itga4R985A/R985A?T細(xì)胞中，F(xiàn)AK和RhoA均未被熱應(yīng)激激活，表明熱應(yīng)激誘導(dǎo)的FAK和RhoA活化依賴于Hsp90-α4結(jié)合。此外，Hsp90誘導(dǎo)的FAK和RhoA活化依賴于α4整合素二聚化。表達(dá)Hsp90-NM（不能誘導(dǎo)α4二聚化）的T細(xì)胞中FAK和RhoA的活化減少，表明Hsp90-NM可能與內(nèi)源性Hsp90競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合α4整合素并因此抑制基礎(chǔ)Hsp90-α4結(jié)合及其下游信號(hào)傳導(dǎo)。

圖9.??Hsp90-α4結(jié)合激活FAK-RhoA GTP酶途徑。

• Hsp90-a4相互作用的破壞會(huì)損害發(fā)熱誘導(dǎo)的T細(xì)胞運(yùn)輸

利用全身熱療（whole-body hyperthermia，WBH，core temperature 39.5℃ ± 0.5℃）分別處理野生型和Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變小鼠，來研究熱應(yīng)激過程中Hsp90-α4軸在T細(xì)胞運(yùn)輸中的作用。WBH處理的WT小鼠Hsp90表達(dá)上調(diào)、T細(xì)胞中Hsp90-a4結(jié)合增強(qiáng)。而Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變小鼠中Hsp90-a4結(jié)合沒有改變，也沒有觀察到WBH誘導(dǎo)的T細(xì)胞粘附和遷移。檢測(cè)各種淋巴組織中T細(xì)胞的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在WT小鼠中，在WBH處理后外周淋巴結(jié)（PLN）、腸系膜淋巴結(jié)（MLN）、PP結(jié)（PP）中T細(xì)胞積累增加，脾和外周血（PB）中的T細(xì)胞降低。由于缺乏HEV結(jié)構(gòu)，脾臟中的T細(xì)胞分布幾乎沒有改變。相反，在WBH處理后，Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變小鼠中PLNs，MLNs和PPs中T細(xì)胞分布的變化明顯不如WT小鼠，表明Hsp90-α4結(jié)合被破壞后會(huì)顯著抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的T細(xì)胞向這些淋巴結(jié)的運(yùn)輸。

圖10. 破壞Hsp90-a4相互作用抑制熱應(yīng)激誘導(dǎo)的T細(xì)胞體內(nèi)遷移

注射LPS將小鼠體溫升高至約38℃，持續(xù)少于6小時(shí)。這樣的體溫升高并未改變小鼠中的Hsp90表達(dá)或T細(xì)胞分布。體外實(shí)驗(yàn)顯示，在38.5℃及以上處理的T細(xì)胞中Hsp90表達(dá)上調(diào)，但在38℃處理的細(xì)胞中沒有表達(dá)。因此，誘導(dǎo)Hsp90表達(dá)和促進(jìn)T細(xì)胞運(yùn)輸需要38.5°C或更高的發(fā)燒溫度。

圖11.??LPS誘導(dǎo)的中度發(fā)熱不會(huì)影響小鼠的T細(xì)胞運(yùn)輸

通過建立鼠傷寒沙門氏菌感染的小鼠模型，導(dǎo)致食物和水傳播的腸胃炎和傷寒，來評(píng)估Hsp90-α4軸在與高熱相關(guān)的病理過程中的作用。鼠傷寒沙門氏菌感染在Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變小鼠中導(dǎo)致比在WT小鼠中更嚴(yán)重的致死性、更嚴(yán)重的腸組織損傷并且在小腸（SI）中的細(xì)菌傳播顯著增加。野生型小鼠感染鼠傷寒沙門氏菌后小腸（SI）、外周淋巴結(jié)（PLN）和脾中的T細(xì)胞增加，并且腸系膜淋巴結(jié)（MLN）、PP結(jié)（PP）和外周血（PB）中的T細(xì)胞減少。而在Itga4R985A/R985A點(diǎn)突變小鼠中，Hsp90-α4結(jié)合被破壞則顯著抑制了PLN中T細(xì)胞分布的變化，SI中T細(xì)胞顯著減少，表明Hsp90-α4結(jié)合一旦被破壞會(huì)抑制細(xì)菌感染期間T細(xì)胞向發(fā)炎組織的募集。這些結(jié)果說明，發(fā)熱會(huì)增強(qiáng)Hsp90-α4軸，這對(duì)于促進(jìn)免疫細(xì)胞運(yùn)輸?shù)桨l(fā)炎組織和促進(jìn)細(xì)菌感染的清除至關(guān)重要。

圖12.? 破壞Hsp90-α4相互作用還削弱了細(xì)菌感染的清除。

發(fā)熱可以通過熱休克蛋白90（Hsp90）誘導(dǎo)α4整合素活化并激活細(xì)胞遷移相關(guān)信號(hào)通路，從而促進(jìn)免疫細(xì)胞遷移到淋巴結(jié)和炎癥部位。

其具體機(jī)制為：發(fā)熱會(huì)上調(diào)T細(xì)胞中Hsp90的表達(dá)并促進(jìn)其與α4整合素胞內(nèi)區(qū)結(jié)合。Hsp90-α4整合素的結(jié)合一方面通過inside-out信號(hào)通路激活α4整合素；另一方面，一個(gè)Hsp90分子可以通過其N端和C端結(jié)構(gòu)域同時(shí)結(jié)合兩個(gè)α4整合素分子，從而引起α4整合素在細(xì)胞膜表面的二聚化和聚簇現(xiàn)象，并激活胞內(nèi)FAK-RhoA信號(hào)通路，最終促進(jìn)T細(xì)胞遷移。通過構(gòu)建α4整合素R985A突變基因敲入小鼠在體內(nèi)破壞Hsp90-α4整合素結(jié)合后，會(huì)抑制發(fā)熱所誘導(dǎo)的T細(xì)胞向引流淋巴結(jié)的遷移，并嚴(yán)重影響T細(xì)胞對(duì)病原菌感染的清除。此外，研究也發(fā)現(xiàn)該機(jī)制同樣適用于發(fā)熱調(diào)控其他α4整合素表達(dá)陽性的免疫細(xì)胞（如單核細(xì)胞、B細(xì)胞等）的定向遷移，說明該機(jī)制適用于多種固有免疫與適應(yīng)性免疫細(xì)胞。

圖13. 發(fā)熱通過Hsp90-α4整合素?zé)岣袘?yīng)信號(hào)通路促進(jìn)T淋巴細(xì)胞遷移

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