2月14日，國際學術(shù)期刊Stem Cell Reports在線發(fā)表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所周斌研究組的科研成果“Lineage Tracing Reveals the Bipotency of SOX9+ Hepatocytes during Liver Regeneration”。該研究利用雙同源重組系統(tǒng)（Cre-loxP和Dre-rox）結(jié)合多種小鼠損傷模型揭示了SOX9⁺肝細胞可以作為肝損傷后的雙能祖細胞，為肝臟的修復和再生研究提供了新的方向和理論基礎(chǔ)。

南模生物為該研究構(gòu)建了Hnf4a-DreER，R26-RSR-LSL-tdTomato和R26-Confetti2三種重要的小鼠模型。

肝臟被稱為人體的“生命塔”，承擔著代謝，解毒，免疫，消化等重要的人體機能。肝臟擁有強大的代償功能，一般輕傷不下火線。但當今社會快速的工作節(jié)奏和不規(guī)律的生活習慣，使得肝損傷在現(xiàn)代都市人群中正成為一種常態(tài)，因此了解肝損傷修復的來龍去脈以搞懂重大肝病的發(fā)病及預防機理一直是學術(shù)研究熱點。

從以往傳統(tǒng)的譜系示蹤研究來看，重生的肝細胞往往都是從損傷前已經(jīng)存在的成熟肝細胞演化而來（并非來源于干細胞分化），而在某些特定損傷情況中，成熟肝細胞還可以分化為膽管上皮細胞。但往往這類研究關(guān)注的是群體水平的遺傳譜系示蹤，單個肝細胞是否可以作為雙向祖細胞同時產(chǎn)生膽管細胞和肝細胞仍然是未知的。

為了改善譜系示蹤精度，研究人員利用基于Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組的報告基因小鼠R26-RSR-LSL-tdTomato，并結(jié)合能特異性標記肝細胞的Hnf4a-DreER小鼠和特異性標記SOX9⁺細胞（包括SOX9⁺肝細胞和膽管上皮細胞）的Sox9-CreER小鼠，通過交配獲得Hnf4a-DreER; Sox9-CreER;R26-RSR-LSL-tdTomato三基因型小鼠，同時使用他莫昔芬誘導，來特異性標記SOX9⁺肝細胞（圖1）。

圖1 SOX9⁺肝細胞遺傳譜系示蹤策略

通過組織免疫熒光檢測，被紅色（RFP）標記上的目標細胞，是位于肝門靜脈區(qū)域的SOX9⁺HNF4a⁺細胞，且其明顯區(qū)別于CK19⁺細胞（膽管上皮細胞），證明此策略能特異性地標記示蹤SOX9⁺肝細胞。

圖2雙重組酶系統(tǒng)的SOX9 ⁺&HNF4a ⁺細胞的遺傳譜系示蹤，證明此策略能特異性地標記示蹤SOX9 ⁺肝細胞。

利用該示蹤系統(tǒng)，研究人員發(fā)現(xiàn)在不同的損傷模型中SOX9⁺肝細胞將有不同的分化方向。例如，若采用CCl4誘導，在肝臟損傷后，SOX9⁺肝細胞可以代償性生長增殖（圖3），而若采用膽管結(jié)扎手術(shù)（BDL）或DDC誘導的膽汁淤積模型，在肝臟損傷后，SOX9⁺肝細胞數(shù)量則會顯著下降，其部分分化成為CK19⁺膽管上皮細胞（圖4）。

圖3 CCl4誘導肝損傷導致SOX9⁺肝細胞代償性生長擴展

圖4 BDL或DDC誘導肝損傷導致SOX9⁺肝細胞具有產(chǎn)生膽管上皮細胞傾向

隨著研究層次進階，研究人員又構(gòu)建了一種新的基于雙系統(tǒng)可用于克隆分析的新報告小鼠R26-Confetti2（圖5），當該小鼠與Cre和Dre小鼠三者雜交時，其三種熒光蛋白YFP，GFP和RFP將以隨機稀疏的方式標記Cre⁺&Dre⁺細胞，以用于克隆分析。

圖5 R26-Confetti2小鼠構(gòu)建策略

研究人員對Hnf4a-DreER; Sox9-CreER; R26-Confetti2三基因小鼠進行DDC誘導肝損傷，利用該克隆分析系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)其細胞標記為三種不同的克?。焊渭毎懝苌掀ぜ毎约鞍渭毎湍懝苌掀ぜ毎幕旌峡寺。▓D6）。這揭示了Sox9⁺的肝細胞亞群在單個細胞水平上確實具有雙向分化的潛能，其在肝損傷和修復期間可以同時分化成肝細胞和膽管上皮細胞。

圖6 肝損傷后雙能SOX9⁺肝細胞分化克隆鑒定

基于SOX9⁺肝細胞在肝損傷修復中雙向分化的獨特能力，它們很有可能成為未來治療重大肝病的重要藥物靶標。