6月5日，國際學(xué)術(shù)期刊Cell Research在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌組的最新研究進(jìn)展“Embryonic senescent cells re-enter cell cycle and contribute to tissues after birth”。此研究揭示了小鼠胚胎發(fā)育過程中衰老細(xì)胞（senescent cell）的命運(yùn)，衰老細(xì)胞不會被全部清除，其中一部分可以保留到出生后，并且部分細(xì)胞會重新進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行增殖。該研究拓寬了人們對細(xì)胞衰老的認(rèn)識，暗示了胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞衰老可能是一個暫時的細(xì)胞狀態(tài)，并且具有可逆性。

P21-CreER 和 P21-tdTomato 基因敲入小鼠模型由南模生物構(gòu)建。

細(xì)胞衰老是指隨著時間的推移或面臨外界應(yīng)激壓力時，細(xì)胞增殖能力減弱，脫離細(xì)胞周期，該過程與機(jī)體衰老(aging)，多種疾?。ㄈ缒[瘤，動脈粥樣硬化等）以及組織的損傷后修復(fù)等過程具有重要的聯(lián)系。近期研究發(fā)現(xiàn)，小鼠正常胚胎發(fā)育過程中中腎管、內(nèi)耳淋巴囊、神經(jīng)管和四肢頂外胚層嵴等處有細(xì)胞衰老的出現(xiàn)，并且揭示了胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞衰老對組織器官的結(jié)構(gòu)形成起到一定作用。而且研究中指出，在胚胎發(fā)育后期，衰老的細(xì)胞都會被清除。然而這些研究都是基于P21的表達(dá)和SAβ-Gal的染色，并不能說明衰老細(xì)胞的真實命運(yùn)。

P21是胚胎衰老的分子標(biāo)志，并且在頂外胚層嵴處（AER）的SAβ-Gal+衰老細(xì)胞中高表達(dá)。研究人員首先通過P21和SAβ-Gal的染色確認(rèn)它們在四肢頂外胚層嵴處（AER）從E15.5天開始消失。

通過將2A-CreER共表達(dá)元件敲入到小鼠P21基因終止密碼子前，構(gòu)建了P21-CreER工具小鼠，與R26-LSL-tdTomato小鼠交配，可由他莫昔芬誘導(dǎo)譜系示蹤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)被tdTomato標(biāo)記的細(xì)胞在E11.5和E12.5天不會增殖，而且會表達(dá)衰老細(xì)胞的marker，P21、CD44和HP1γ。另外，通過FACS分選E12.5天被標(biāo)記的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞都會呈現(xiàn)SAβ-Gal的活性。證明了工具小鼠可以在體內(nèi)標(biāo)記胚胎時期的衰老細(xì)胞，并且可運(yùn)用P21-CreER小鼠研究衰老細(xì)胞的命運(yùn)。

利用P21-CreER;R26-tdTomato小鼠對胚胎時期的衰老細(xì)胞進(jìn)行譜系示蹤研究，發(fā)現(xiàn)四肢頂外胚層嵴處的衰老細(xì)胞在E15.5和E16.5天并不會完全被清除，而是一直能存活到出生后，只是不再表達(dá)P21，也沒有了SAβ-Gal的活性。通過EdU和Ki67染色發(fā)現(xiàn)，示蹤的衰老細(xì)胞在胚胎發(fā)育后期會進(jìn)入細(xì)胞周期，重新增殖。其他衰老的組織器官處的衰老細(xì)胞也存在同樣的現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)首次在體內(nèi)揭示了衰老細(xì)胞的命運(yùn)，并且暗示了胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞衰老是一個暫時的細(xì)胞狀態(tài)，而且具有可逆性，也為治療細(xì)胞衰老引起的疾病提供了一個新的思路。

小鼠胚胎期衰老細(xì)胞在胚胎發(fā)育后期重新進(jìn)入細(xì)胞周期并貢獻(xiàn)至出生后的組織

a. 小鼠E10.5-P0天前肢SAβ-Gal染色。箭頭指示SAβ-Gal陽性細(xì)胞，在E10.5-E14.5天頂端外胚層脊髓（AER）有陽性SAβ-Gal信號。

b. SAβ-Gal活性示意圖。證明SAβ-Gal染色檢測到的衰老細(xì)胞存在于E10.5-E14.5，而E15.5天后SAβ-Gal活性消失。

c. P21-CreER基因敲入工具鼠構(gòu)建示意圖。?

d. P21-CreER小鼠胚胎整體P21和ESR免疫染色與胚胎肢體中的SAβ-Gal具有相似的表達(dá)模式（與圖a相比），表明衰老細(xì)胞的AER在中期表達(dá)高水平的P21（例如E10.5-E13.5）。?

e. P21-CreER小鼠四肢P21和CreER表達(dá)譜示意圖。 E10.5-E13.5胚胎前肢中的CreER表達(dá)主要在AER內(nèi)，而E14.5天開始P21和CreER的表達(dá)下降，E15.5天后就消失了，與內(nèi)源性P21表達(dá)基本一致。

f. P21-CreER小鼠四肢切片P21和ESR免疫染色結(jié)果。

g. 他莫昔芬誘導(dǎo)Cre-loxP重組譜系示蹤策略示意圖，他莫昔芬誘導(dǎo)后CreER入核發(fā)揮重組活性，使表達(dá)P21的細(xì)胞被標(biāo)記上tdTomato熒光信號。?

h. 誘導(dǎo)譜系示蹤流程圖。?

i. P21-CreER;R26-tdTomato小鼠未經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)時胚胎整體/切片中沒有tdTomato的表達(dá)，表明沒有P21-CreER的泄漏。

j. E12.5-P0天P21-CreER;R26-tdTomato小鼠他莫昔芬誘導(dǎo)示蹤后，在胚胎發(fā)育中期AER中很容易檢測到tdTomato陽性細(xì)胞。而在胚胎發(fā)育晚期，仍有部分被tdTomato標(biāo)記的P21陽性衰老細(xì)胞維持著上皮細(xì)胞的命運(yùn)。

k. E15.5和E16.5天四肢切片中tdTomato、EdU、 E-cadherin (E-Cad)免疫染色。箭頭表示增殖的tdTomato陽性細(xì)胞（約有10%的tdTomato+EdU+細(xì)胞），表明它們重新進(jìn)入細(xì)胞周期開始增殖。

l.? 增殖的tdTomato陽性上皮細(xì)胞定量統(tǒng)計。tdTomato+和tdTomato-上皮細(xì)胞之間的EdU摻入沒有顯著差異。

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