Cell Stem Cell | 南模生物構(gòu)建70余種遺傳工具小鼠助力譜系示蹤研究

闡明器官發(fā)育與組織再生中細(xì)胞起源和命運(yùn)調(diào)控機(jī)制對(duì)深入了解體內(nèi)細(xì)胞命運(yùn)可塑性具有重要意義。Cre-loxP等同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤及遺傳靶向操作技術(shù)是揭示體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)功能的重要工具，不僅可以用于深入研究器官發(fā)育和再生過(guò)程中的分子機(jī)制，也是追蹤體內(nèi)細(xì)胞起源和命運(yùn)調(diào)控的重要手段。該技術(shù)能否精確進(jìn)行遺傳操作的關(guān)鍵在于驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)的基因/啟動(dòng)子是否特異，目前部分研究中使用的驅(qū)動(dòng)Cre表達(dá)的基因/啟動(dòng)子并不特異，容易造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性，以致于在細(xì)胞命運(yùn)和基因功能分析等研究中出現(xiàn)諸多爭(zhēng)議。在以往的研究中，中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組開(kāi)發(fā)了基于Dre-rox與Cre-loxP雙同源重組酶系統(tǒng)的遺傳譜系示蹤新技術(shù)【1】，利用該技術(shù)他們解決了心血管領(lǐng)域中有關(guān)成體心臟干細(xì)胞的重大科學(xué)爭(zhēng)議【2】。



2021年2月9日，來(lái)自中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周斌研究組和上海市胸科醫(yī)院何奔研究組合作在國(guó)際知名學(xué)術(shù)期刊Cell Stem Cell發(fā)表了題為?A Suite of New Dre-recombinase Drivers Markedly Expands the Ability to Perform Intersectional Genetic Targeting?的文章【3】，該研究構(gòu)建了多種基于Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組酶系統(tǒng)的遺傳工具小鼠，設(shè)計(jì)了多種遺傳示蹤和靶向操作的新策略，不僅實(shí)現(xiàn)了更為精準(zhǔn)地遺傳譜系示蹤和遺傳靶向操作，還極大的拓寬了遺傳示蹤和靶向操作技術(shù)使用范圍。利用新的遺傳工具和策略，他們首先對(duì)脂肪組織進(jìn)行了深入系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)了成體脂肪干細(xì)胞。該研究創(chuàng)建的遺傳新工具和策略適用于多種組織器官的發(fā)育、疾病和再生等研究，為深入了解器官發(fā)育，組織穩(wěn)態(tài)和再生過(guò)程中細(xì)胞起源及命運(yùn)調(diào)控機(jī)制提供了更多更強(qiáng)大的遺傳工具。

南模生物為該研究構(gòu)建了70余種遺傳工具小鼠。
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近年來(lái)，全球肥胖人數(shù)日益增多，肥胖已成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，它給人類(lèi)帶來(lái)的影響不僅是外貌體態(tài)的改變，更重要的是肥胖所引起的一系列疾病，如高血壓、心腦血管疾病、糖尿病乃至惡性腫瘤等，嚴(yán)重威脅人們的健康。脂肪細(xì)胞數(shù)量增加和體積增大是肥胖最主要的特征。哺乳動(dòng)物的脂肪細(xì)胞主要分為兩種：一種是儲(chǔ)存脂質(zhì)的白色脂肪細(xì)胞，它包含一個(gè)占據(jù)大部分細(xì)胞體積的單個(gè)大脂質(zhì)囊泡和少量的線粒體；另一種是燃燒脂質(zhì)產(chǎn)生熱量的褐色脂肪細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含有一些分散的小脂滴和大量的線粒體。肥胖主要是由于白色脂肪細(xì)胞的大量堆積，目前，在成體組織穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激條件下，新生白色脂肪細(xì)胞的來(lái)源并不完全清楚。

近十年來(lái)有大量研究結(jié)果表明，成體白色脂肪細(xì)胞的生成是在脂肪組織的血管壁附近進(jìn)行的。血管壁從內(nèi)到外主要由三層細(xì)胞構(gòu)成：血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管壁細(xì)胞（包括周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞。2008年，Jonathan M. Graff研究組在Science報(bào)道了脂肪干細(xì)胞主要來(lái)源于血管壁上的周細(xì)胞，并利用譜系示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)PDGFRb+血管周細(xì)胞可以在正常生理?xiàng)l件下產(chǎn)生新的脂肪細(xì)胞【4】。隨后，Rana K. Gupta研究組證實(shí)了PDGFRb+的血管周細(xì)胞可以在應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)分化為脂肪細(xì)胞【5】。然而，在2017年，Sylvia M. Evans研究組利用基于Tbx18的遺傳工具對(duì)血管周細(xì)胞做了更為詳盡的細(xì)胞譜系示蹤工作，他們的研究結(jié)果否定了血管周細(xì)胞是脂肪干細(xì)胞的結(jié)論【6】。

為解決以上科學(xué)爭(zhēng)議，周斌研究組和何奔研究組合作創(chuàng)建了多種新的Dre和Cre工具小鼠，并結(jié)合Cre-loxP和Dre-rox雙同源重組酶系統(tǒng)，對(duì)脂肪組織中PDGFRb+的細(xì)胞和PDGFRa+的細(xì)胞進(jìn)行遺傳譜系示蹤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了一個(gè)既表達(dá)PDGFRa又表達(dá)PDGFRb的細(xì)胞亞群。利用雙同源重組的譜系示蹤技術(shù)，他們實(shí)現(xiàn)了將PDGFRa單陽(yáng)性細(xì)胞、PDGFRb單陽(yáng)性細(xì)胞和PDGFRa/PDGFRb雙陽(yáng)性細(xì)胞在一個(gè)小鼠體內(nèi)同時(shí)進(jìn)行特異性標(biāo)記。在冷刺激環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)只有PDGFRa單陽(yáng)性細(xì)胞和PDGFRa/PDGFRb雙陽(yáng)性細(xì)胞才會(huì)轉(zhuǎn)分化形成脂肪細(xì)胞，并揭示PDGFRa/PDGFRb雙陽(yáng)性細(xì)胞群具有更強(qiáng)的產(chǎn)生新脂肪細(xì)胞的能力，該研究首次發(fā)現(xiàn)了PDGFRa/PDGFRb雙陽(yáng)性細(xì)胞是成體脂肪干細(xì)胞?（圖1）。
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圖1




進(jìn)一步對(duì)小鼠脂肪組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，PDGFRa單陽(yáng)性細(xì)胞亞群和PDGFRa/PDGFRb雙陽(yáng)性細(xì)胞亞群在基因表達(dá)水平上是具有顯著差異的（圖2）。PDGFRa/PDGFRb雙陽(yáng)性細(xì)胞亞群會(huì)高表達(dá)Cxcl14, Steap4和Col15a1等基因，而PDGFRa單陽(yáng)性細(xì)胞亞群則高表達(dá)Pi16, Sbsn和Dpp4等基因。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PDGFRa/PDGFRb雙陽(yáng)性細(xì)胞亞群中的上調(diào)基因與細(xì)胞外組織結(jié)構(gòu)、血管發(fā)育、對(duì)傷口的應(yīng)激以及脂肪細(xì)胞分化等信號(hào)調(diào)控等相關(guān)。
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圖2




迄今為止，由于遺傳工具小鼠的局限性，缺乏特異性靶向白色脂肪細(xì)胞和特異性靶向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遺傳工具。現(xiàn)有的脂肪細(xì)胞Cre工具小鼠會(huì)同時(shí)靶向白色脂肪細(xì)胞和褐色脂肪細(xì)胞，而現(xiàn)有的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞Cre的工具小鼠，例如Prox1-Cre在靶向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)靶向心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等其它類(lèi)型細(xì)胞。周斌研究組和何奔研究組在該項(xiàng)研究中創(chuàng)建了更精確的基因靶向策略，通過(guò)利用雙同源重組的交叉遺傳學(xué)設(shè)計(jì)了“NOT”和“AND” 兩種遺傳策略，能實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的譜系示蹤和遺傳靶向操作，用于體內(nèi)基因功能的研究。利用“NOT”策略，他們創(chuàng)建了白色脂肪細(xì)胞的特異性靶向工具；利用“AND”策略，他們創(chuàng)建了淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的遺傳靶向工具?！癗OT”邏輯策略類(lèi)比于數(shù)學(xué)集合中的取補(bǔ)集過(guò)程，即把所有的脂肪細(xì)胞看作集合S，褐色脂肪細(xì)胞群為S的一個(gè)子集A, 白色脂肪細(xì)胞群就是取子集A在S中的補(bǔ)集?！癆ND”的邏輯學(xué)策略類(lèi)比于數(shù)學(xué)集合中的取交集過(guò)程，即把內(nèi)皮細(xì)胞群（血管內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞等）類(lèi)比于集合A，PROX1標(biāo)記的所有細(xì)胞（淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞等）類(lèi)比于集合B，淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞就是取A和B的交集。

綜上，該項(xiàng)研究建立和推廣了雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤和遺傳靶向操作新技術(shù)，建立了多種遺傳示蹤和靶向操作的新策略，為多種組織器官的發(fā)育、疾病、再生等研究提供的強(qiáng)大的技術(shù)基礎(chǔ)。該研究著重研究了成體脂肪組織中新生脂肪細(xì)胞的來(lái)源，通過(guò)對(duì)脂肪組織血管周?chē)喾N不同細(xì)胞亞群的同時(shí)進(jìn)行遺傳示蹤，發(fā)現(xiàn)了成體脂肪干細(xì)胞，為進(jìn)一步研究肥胖及肥胖相關(guān)的慢性疾病提供了新方向。為拓展雙同源重組遺傳譜系示蹤技術(shù)的應(yīng)用，該研究分別介紹了“NOT”(比如白色脂肪特異性靶向工具)?與“AND”?(比如淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性靶向工具)?的應(yīng)用，為進(jìn)一步研究白色脂肪細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的功能調(diào)控機(jī)制研究提供了更精準(zhǔn)的遺傳靶向操作工具（圖3）。
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圖3



*本文轉(zhuǎn)載自BioArt公眾號(hào)



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