2023年3月24日，上海市免疫學(xué)研究所葉菱秀團(tuán)隊(duì)在Science Immunology期刊在線發(fā)表了題為“DNA Repair Mechanisms That Promote Insertion-Deletion Events During Immunoglobulin Gene Diversification”的研究論文。該論文鑒定了在抗體多樣化過程中低頻率DNA片段插入事件和±1bp缺失或插入事件，揭示了±1bp和>1bp缺失或插入產(chǎn)生機(jī)制的差異。在此基礎(chǔ)上，通過外切酶或聚合酶的遺傳學(xué)操作獲得了能夠增加抗體基因缺失或插入的小鼠模型，為廣譜中和抗體的篩選提供了新的思路和方法。

南模生物為該研究構(gòu)建了多種基因修飾小鼠：Fen1-KO, Ung-KO, Polh-KO, Msh2-KO, Exo1-KO, Pms2-KO, Mlh1-KO, Apex2-KO, R26-LSL-Trex2-IRES-GFP。

DNA片段缺失或插入是基因組中單個(gè)或多個(gè)核苷酸的缺失或插入。在免疫球蛋白即抗體的基因可變區(qū)外顯子中，片段缺失或插入(<50 bp)通常會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞受體編碼錯(cuò)誤。然而，“塞翁失馬，焉知禍?！?，長(zhǎng)片段缺失或插入又是罕見抗病毒廣譜中和抗體(broadly neutralizing antibody, bnAbs)獲得廣譜中和能力的關(guān)鍵。例如，發(fā)生在抗HIV廣譜中和抗體基因上的片段插入大大提高了抗體與HIV包膜三聚體表位的結(jié)合力。但是，由于片段缺失或插入在抗體多樣化過程中發(fā)生頻率較低，很難用傳統(tǒng)模型和方法檢測(cè)得到。因此，片段缺失或插入在抗體多樣化中的分子機(jī)制仍知之甚少。

本研究利用一種抗體無功能等位基因系統(tǒng)，同時(shí)結(jié)合超深度測(cè)序克服了片段缺失或插入檢測(cè)的困難，成功捕捉到生理?xiàng)l件下真實(shí)的片段缺失或插入事件（圖1）。通過對(duì)片段缺失或插入圖譜的分析發(fā)現(xiàn)±1bp缺失或插入發(fā)生最頻繁，占總?cè)笔Щ虿迦胧录?5%左右（圖2）。對(duì)>1bp堿基插入的序列特征進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)大部分的堿基插入為鄰近序列的復(fù)制插入。發(fā)生在CDR3上的復(fù)制插入能夠增加CDR3的長(zhǎng)度，可能促進(jìn)廣譜中和抗體的產(chǎn)生。

在體細(xì)胞高頻突變（Somatic Hypermutation, SHM）過程中，胞苷脫氨酶AID能夠作用于抗體可變區(qū)基因，引起DNA損傷。該損傷可以通過堿基切除修復(fù)途徑（base excision repair, BER）或錯(cuò)配修復(fù)途徑（mismatch repair, MMR）進(jìn)行修復(fù)，產(chǎn)生堿基突變以及DNA片段的缺失或插入。為了探究DNA片段缺失或插入產(chǎn)生的分子機(jī)制，本研究在抗體無功能等位基因小鼠模型基礎(chǔ)上構(gòu)建了15種具有代表性的DNA損傷應(yīng)答修復(fù)因子缺陷小鼠模型（圖1），并對(duì)其片段缺失或插入圖譜進(jìn)行了系統(tǒng)的描繪（圖3）。研究發(fā)現(xiàn)±1bp與>1bp缺失或插入產(chǎn)生的分子機(jī)制截然不同（圖3-4），1bp缺失通過BER途徑產(chǎn)生，1bp插入既可以通過BER途徑產(chǎn)生，也可以通過MMR途徑產(chǎn)生，產(chǎn)生過程需要核酸外切酶ExoI和易錯(cuò)DNA聚合酶Polη的參與。>1bp缺失或插入都是通過BER途徑產(chǎn)生的，并且都需要DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)因子53BP1的參與。此外，>1bp插入還需要非同源末端連接途徑和DNA聚合酶Polλ的參與。對(duì)片段缺失或插入分子機(jī)制的全面解析有助于理解廣譜中和抗體產(chǎn)生的機(jī)制，為廣譜中和抗體的生產(chǎn)提供了新的思路，為HIV等疫苗的設(shè)計(jì)提供了新的理論基礎(chǔ)。

在機(jī)制研究基礎(chǔ)上，本研究成功構(gòu)建了能夠增加抗體基因缺失或插入頻率的小鼠模型（圖3），核酸外切酶Trex2過表達(dá)的小鼠模型能夠促進(jìn)片段缺失的產(chǎn)生，DNA聚合酶Polβ條件性敲除的小鼠模型能夠促進(jìn)片段插入的產(chǎn)生。這兩種小鼠模型可以與人源化抗體小鼠模型聯(lián)合使用，用于疫苗的研發(fā)和廣譜中和抗體的生產(chǎn)。

圖4：抗體基因SHM中DNA片段缺失或插入機(jī)制的系統(tǒng)解析

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所葉菱秀研究員，瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院Qiang Pan-Hammarstr?m教授和意大利都靈大學(xué)病理學(xué)系Roberto Chiarle教授為本論文的共同通訊作者，郝茜助理研究員和占傳棕博士研究生為本論文的共同第一作者。