心力衰竭每年都會(huì)導(dǎo)致全球范圍內(nèi)大量的個(gè)體致病或死亡。在心臟損傷早期，心臟成纖維細(xì)胞被激活并分化成具有收縮性的肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量的胞外基質(zhì)，生成富含膠原的疤痕，修補(bǔ)由于心肌死亡導(dǎo)致的心臟缺損，維持心臟基本功能。然而，成纖維細(xì)胞增殖過多會(huì)導(dǎo)致胞外基質(zhì)的過度積累并導(dǎo)致心臟彈性減弱，降低心室壁的順應(yīng)性，從而嚴(yán)重影響心臟功能，最終促使心力衰竭。因此，了解驅(qū)動(dòng)心臟纖維化病理過程的基本機(jī)制，對(duì)于把控成纖維細(xì)胞在心臟損傷后的適度增殖，更大程度地發(fā)揮成纖維細(xì)胞保護(hù)心臟功能的作用至關(guān)重要，并為開發(fā)治療心臟纖維化的潛在靶標(biāo)提供新的思路和見解，對(duì)緩解心臟衰竭、提高患者生存質(zhì)量具有臨床指導(dǎo)意義。
2023年3月23日，中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組在Nature Genetics上發(fā)表了題為 “Dual genetic tracing reveals a unique fibroblast subpopulation modulating cardiac fibrosis”?的研究論文。周斌研究組開發(fā)了雙同源重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤系統(tǒng)來特異性追蹤心內(nèi)膜起源的成纖維細(xì)胞（Endocardium-derived fibroblast,?EndoFb），揭示了EndoFb是調(diào)節(jié)心臟纖維化的獨(dú)特成纖維細(xì)胞亞群。利用EndoFb-tracer系統(tǒng)，研究人員發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育和成體穩(wěn)態(tài)情況下EndoFb具有非常明顯的區(qū)域性分布特征，在心臟壓力負(fù)荷下（TAC模型），EndoFb比其他成纖維細(xì)胞亞群更具增殖潛能。通過Fb-ProTracer系統(tǒng)，研究人員實(shí)現(xiàn)了不依賴于預(yù)先標(biāo)記成纖維細(xì)胞亞群、無偏好地評(píng)估成纖維細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)或損傷后的增殖情況，揭示了TAC后成纖維細(xì)胞的增殖區(qū)域性。利用EndoFb-DTR系統(tǒng)，研究人員在遺傳學(xué)水平上特異性清除EndoFb，發(fā)現(xiàn)EndoFb清除后可顯著緩解TAC引起的心臟纖維化并減緩了心臟衰竭的進(jìn)程，證實(shí)了EndoFb調(diào)控心臟纖維化和病理性心肌重塑。通過構(gòu)建成纖維細(xì)胞亞群特異性基因敲除Ctnnb1-KO系統(tǒng)，揭示W(wǎng)nt信號(hào)通路是TAC后調(diào)控EndoFb擴(kuò)張的重要分子機(jī)制。
南模生物為該研究構(gòu)建了多種基因修飾小鼠：R26-LSL-RSR-tdT-DTR, Tnnt2-Dre-Cre-tdTomato, Npr3-tTA以及Col1a2-RSR-CreER等。
之前的研究主要用單同源重組酶介導(dǎo)的譜系示蹤方法，通過心內(nèi)膜的遺傳工具小鼠和心外膜的遺傳工具小鼠去研究心內(nèi)膜衍生的成纖維細(xì)胞和心外膜衍生的成纖維細(xì)胞。然而，傳統(tǒng)的遺傳譜系示蹤方法雖然能夠示蹤到不同的成纖維細(xì)胞亞群，但是由于心內(nèi)膜細(xì)胞和心外膜細(xì)胞還會(huì)貢獻(xiàn)給許多其他細(xì)胞類型，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，這些細(xì)胞類型的存在不僅會(huì)干擾研究人員對(duì)成纖維細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)和損傷情況下的表型探究，也無法僅對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行特異性的遺傳操作，這就使得探究不同成纖維細(xì)胞亞群對(duì)心臟纖維化和心力衰竭影響的潛在機(jī)制成為一個(gè)難題。
本研究中，研究人員首先構(gòu)建了高效穩(wěn)定的特異性追蹤心內(nèi)膜來源的成纖維細(xì)胞亞群的遺傳學(xué)模型，為探究EndoFb在心臟纖維化過程中的細(xì)胞及分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。研究人員將心內(nèi)膜的工具小鼠Nfatc1-Dre，成纖維細(xì)胞的工具小鼠Col1a2-CreER，與雙系統(tǒng)報(bào)告基因小鼠R26-RL-GFP交配，產(chǎn)生Nfatc1-Dre;Col1a2-CreER;R26-RL-GFP（EndoFb-tracer）小鼠。在該系統(tǒng)中，Dre-rox重組去除第一個(gè)Stop，隨后的Cre-loxP重組在他莫西芬（Tam）誘導(dǎo)下去除第二個(gè)Stop，實(shí)現(xiàn)了用GFP報(bào)告基因永久遺傳標(biāo)記EndoFb。在發(fā)育的心臟中對(duì)EndoFb-tracer小鼠進(jìn)行Tam注射，研究人員發(fā)現(xiàn)GFP+的EndoFb主要分布在室間隔的上半部分和左心室的小梁心肌層，較少分布于右心室以及左心室的致密心肌層。為了在成體損傷情況下高效標(biāo)記EndoFb和其他成纖維細(xì)胞亞群，研究人員在EndoFb-tracer系統(tǒng)中引入R26-LSL-tdTomato報(bào)告基因小鼠，在Nfatc1-Dre;Col1a2-CreER;R26-RL-GFP;R26-LSL-tdTomato四基因小鼠中，EndoFb被標(biāo)記成GFP+tdTomato+，其他來源的成纖維細(xì)胞（主要是EpiFb）被標(biāo)記為GFP–tdTomato+。通過流式細(xì)胞術(shù)和EdU摻入實(shí)驗(yàn)，研究人員發(fā)現(xiàn)，TAC損傷后EndoFb的擴(kuò)增潛能明顯高于其他來源的成纖維細(xì)胞，且在纖維化區(qū)域高度富集。
圖1. 利用雙重組酶特異性標(biāo)記EndoFb并發(fā)現(xiàn)其在心臟壓力負(fù)荷后顯著擴(kuò)增
為了在心臟損傷后無偏好地評(píng)估成纖維細(xì)胞的增殖情況，研究人員在最近報(bào)道的體內(nèi)細(xì)胞增殖示蹤技術(shù)ProTracer的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了成纖維細(xì)胞特異的Fb-ProTracer系統(tǒng)。利用Col1a2-CreER這個(gè)成纖維細(xì)胞工具小鼠，結(jié)合Ki67-LSL-2A-Dre，以及雙系統(tǒng)報(bào)告基因小鼠R26-RL-GFP，獲得Col1a2-CreER;Ki67-LSL-2A-Dre;R26-RL-GFP（Fb-ProTracer）小鼠。在該系統(tǒng)中，Tam會(huì)誘導(dǎo)Col1a2-CreER中的CreER入核以去除Ki67-LSL-2A-Dre中的Stop序列，產(chǎn)生一個(gè)新的Ki67-2A-Dre等位基因；并去除R26-RL-GFP等位基因的第一個(gè)Stop序列，注射Tam后，Ki67-2A-Dre將切除增殖的成纖維細(xì)胞中的第二個(gè)Stop序列，并開始連續(xù)記錄增殖的成纖維細(xì)胞。對(duì)TAC后的Fb-ProTracer小鼠進(jìn)行分析，研究人員發(fā)現(xiàn)GFP+的成纖維細(xì)胞主要集中在室間隔和左心室的上半部分，該表型與EndoFb在TAC損傷后的區(qū)域性擴(kuò)張高度一致，進(jìn)一步提示EndoFb在TAC損傷后增殖的活躍性以及EndFb在該損傷模型下對(duì)纖維化的重要貢獻(xiàn)。
為了探究TAC損傷后EndoFb對(duì)心臟纖維化的在體功能，研究人員構(gòu)建了Nfatc1-Dre;Col1a2-CreER;R26-LSL-RSR-tdT-DTR（EndoFb-DTR）小鼠，在該系統(tǒng)中，Dre-rox和Cre-loxP重組同時(shí)介導(dǎo)了tdTomato和白喉毒素受體（DTR）在EndoFb中的專一性表達(dá)。對(duì)EndoFb-DTR小鼠進(jìn)行Tam注射，可將EndoFb標(biāo)記成紅色，對(duì)EndoFb-DTR小鼠進(jìn)行DT處理，又可實(shí)現(xiàn)對(duì)tdTomato+的EndoFb遺傳性清除。在TAC后第8天對(duì)EndoFb-DTR小鼠進(jìn)行DT注射以清除EndoFb，在TAC后第28天收集EndoFb-DTR小鼠心臟進(jìn)行組織學(xué)分析，結(jié)果表明，與PBS處理的對(duì)照組相比，DT處理組的小鼠心臟纖維化程度減弱，心臟肥大水平下降，心肌細(xì)胞大小更接近野生型小鼠。對(duì)PBS處理組小鼠和DT處理組小鼠進(jìn)行心臟功能連續(xù)監(jiān)測(cè)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，DT處理組小鼠心臟功能下降趨勢(shì)相較于PBS處理組小鼠明顯減緩。綜合以上數(shù)據(jù)，研究人員認(rèn)為EndoFb對(duì)TAC后的心臟纖維化具有重要貢獻(xiàn)，減少EndoFb在TAC后的數(shù)量將有效保護(hù)心臟功能，減緩心臟衰竭進(jìn)程。
圖2. EndoFb清除后可以顯著緩解心臟纖維化
鑒于EndoFb在TAC損傷后具有更強(qiáng)的增殖潛能，且在TAC后消除EndoFb在一定程度上減輕了心臟纖維化，為探索調(diào)控EndoFb潛在的分子機(jī)制，研究人員從EndoFb-tracer小鼠的心室中分離出GFP+和GFP–的成纖維細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq分析。在假手術(shù)（Sham）組和TAC組的心臟中，跟成纖維細(xì)胞激活有關(guān)的基因，如Thbs4、Cilp、Postn、Comp、Fmod、Cthrc1和Ddah1，在GFP+的成纖維細(xì)胞中表達(dá)均比其在GFP–的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)更高?；蚋患治鲲@示，與GFP–的成纖維細(xì)胞相比，GFP+的成纖維細(xì)胞中的Wnt信號(hào)通路和成纖維細(xì)胞增殖通路均受到正向調(diào)節(jié)。基因表達(dá)熱圖表明，與Wnt信號(hào)通路相關(guān)的基因，如Wnt10b、Ccn4、Wnt9a、Fzd4、Fzd7、Sox9、Lzts2和Dkk3，在Sham組和TAC組的GFP+的成纖維細(xì)胞中均被上調(diào)。綜合RNA-seq的數(shù)據(jù)，研究人員認(rèn)為，TAC損傷后，EndoFb相較于心臟中其他成纖維細(xì)胞亞群處于一種更活化的狀態(tài)，且具有更活躍的增殖信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路基因的活化。
為了在EndoFb中特異性敲除Wnt信號(hào)通路，研究人員構(gòu)建了Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;Ctnnb1-flox小鼠（Ctnnb1-KO系統(tǒng)）。在這種設(shè)計(jì)中，Nfatc1-Dre中的Dre切除掉Col1a2-RSR-CreER中的rox-Stop-rox，將其變成Col1a2-CreER等位基因，CreER在Tam的作用下切除Ctnnb1-flox中的Exon1-4，從而實(shí)現(xiàn)僅在心內(nèi)膜來源的成纖維細(xì)胞中敲除Ctnnb1。為了同時(shí)追蹤EndoFb并敲除EndoFb中的Ctnnb1，研究人員將Ctnnb1-KO系統(tǒng)與R26-RL-GFP交配，獲得Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP;Ctnnb1-fl小鼠，并將其作為突變體小鼠，同時(shí)將它們的同窩小鼠Nfatc1-Dre;Col1a2-RSR-CreER;R26-RL-GFP;Ctnnb1-wt作為對(duì)照，用于TAC后的分析。對(duì)TAC后28天的對(duì)照組小鼠心臟和突變體小鼠心臟進(jìn)行組織學(xué)分析，結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，突變體小鼠心臟中纖維化程度減輕，心臟肥大水平下降，心肌細(xì)胞大小更接近野生型小鼠。對(duì)照組小鼠和突變體小鼠進(jìn)行心臟功能連續(xù)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示突變體小鼠心臟功能下降趨勢(shì)相較于對(duì)照組小鼠明顯減緩。這些數(shù)據(jù)表明，在EndoFb中特異性敲除Ctnnb1能明顯減少TAC所導(dǎo)致的心臟纖維化，并能保護(hù)心臟功能。以上研究揭示了先前一直未受重視的起源于心內(nèi)膜的獨(dú)特成纖維細(xì)胞亞群（EndoFb），發(fā)現(xiàn)該亞群的成纖維細(xì)胞在心臟纖維化病理過程中具有重要的調(diào)節(jié)功能，為未來心臟疾病的治療提供了一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。該研究也展示了使用雙重組酶介導(dǎo)的遺傳譜系示蹤技術(shù)對(duì)于研究體內(nèi)某個(gè)細(xì)胞亞群在特定疾病發(fā)展過程中的機(jī)制和功能的優(yōu)勢(shì)，為研究亞群細(xì)胞對(duì)多種疾病的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。
圖3. 靶向EndoFb可減緩心臟纖維化和心功能衰竭
文章鏈接：https://www.nature.com/articles/s41588-023-01337-7
