北京時(shí)間12月2日，國際學(xué)術(shù)期刊Science以Research Article的形式在線發(fā)表了中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心（生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）周斌研究組的最新成果“Monitoring of cell-cell communication and contact history in mammals”。該研究基于合成生物學(xué)結(jié)合體內(nèi)遺傳學(xué)技術(shù)，開發(fā)了可以捕捉體內(nèi)細(xì)胞間相互作用并能夠永久追蹤?quán)徑?xì)胞的創(chuàng)新研究工具——鄰近細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)。利用該技術(shù)，研究人員揭示了心臟內(nèi)皮細(xì)胞在早期胚胎發(fā)育過程中遷移到肝臟并轉(zhuǎn)變成為肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞，以及在腫瘤生長過程中腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移到腫瘤外包膜的現(xiàn)象，該研究工作將極大地推動(dòng)對體內(nèi)細(xì)胞間相互作用的深入探索。

南模生物為該研究提供了Tnnt2-mGFP, Alb-mGFP, Cdh5-aGFP-N-tTA, R26-mGFP, Pdgfra-aGFP-N-tTA, H11-aGFP-N-tTA, tetO-Dre-BFP 和 Tigre-synNotch 小鼠。

細(xì)胞之間的交流和相互作用是維持生物體生命活動(dòng)有序進(jìn)行的必要條件，解析細(xì)胞之間的相互作用對于深入了解多種生物學(xué)過程及其調(diào)控機(jī)制具有重要意義。近30年來，科學(xué)家利用傳統(tǒng)的遺傳示蹤、組織特異性基因敲除或過表達(dá)等技術(shù)，只能針對特定細(xì)胞自身進(jìn)行細(xì)胞或分子水平的操作，深入解析細(xì)胞之間的相互作用依然面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，亟需建立一種新的遺傳操作技術(shù)，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)監(jiān)測與記錄細(xì)胞之間相互作用，為推動(dòng)細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展提供新的強(qiáng)有力工具。

Notch信號通路是細(xì)胞之間交流的經(jīng)典信號通路，以往報(bào)道將其改造并加入人工調(diào)控元件，用來研究細(xì)胞之間的相互作用（Morsut et al.,?Cell?2016）。在兩個(gè)細(xì)胞中分別表達(dá)人工合成的Notch配體和受體蛋白后，當(dāng)細(xì)胞相互接觸時(shí)，受體和配體特異性結(jié)合，引起受體跨膜段的構(gòu)象改變；接著，γ-secretase將切斷受體跨膜段和胞內(nèi)段的連接，釋放胞內(nèi)段的人工合成遺傳元件，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Gal4、tTA等，這些遺傳元件可以進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控下游基因的表達(dá)，該技術(shù)被稱為人工合成Notch信號通路—Synthetic Notch (synNotch)。

周斌研究組長期致力于小鼠體內(nèi)遺傳學(xué)技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用。在該項(xiàng)研究中，研究人員經(jīng)過不斷探索和優(yōu)化，建立了一種檢測體內(nèi)細(xì)胞之間相互作用的新技術(shù)——鄰近細(xì)胞遺傳標(biāo)記技術(shù)。他們首先以心臟中心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞為例，證明該技術(shù)可以在體內(nèi)將細(xì)胞接觸信息轉(zhuǎn)變?yōu)檫z傳信號。他們將心肌細(xì)胞作為synNotch信號發(fā)送細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞作為synNotch信號接收細(xì)胞，分別構(gòu)建了心肌細(xì)胞特異性表達(dá)synNotch配體的工具小鼠Tnnt2-mGFP，以及內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)synNotch受體的工具小鼠Cdh5-αGFP-N-tTA（Cdh5-GFP nanobody-Notch transmembrane domain-tTA）。在Tnnt2-mGFP;Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-nLacZ小鼠中，當(dāng)未發(fā)生細(xì)胞接觸時(shí)，synNotch受體的酶切位點(diǎn)被隱藏在特定蛋白區(qū)域內(nèi)；當(dāng)細(xì)胞相互接觸時(shí)，心肌細(xì)胞膜表面的GFP蛋白和內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的GFP抗體特異性結(jié)合，激活synNotch信號通路，受體胞內(nèi)段的tTA進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核中并結(jié)合tetO轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，激活報(bào)告基因nLacZ的表達(dá)，顯示出與心肌細(xì)胞接觸的內(nèi)皮細(xì)胞，驗(yàn)證了該技術(shù)的可行性。隨后，為了更加方便熒光成像和細(xì)胞分選，研究人員引入了tetO-tdT熒光報(bào)告基因小鼠，更加直觀地展現(xiàn)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的接觸。上述結(jié)果證明了鄰近細(xì)胞遺傳標(biāo)記技術(shù)的成功建立。此外，研究人員也證明該技術(shù)同樣適用于其他組織中細(xì)胞相互作用的研究。

鄰近細(xì)胞遺傳標(biāo)記技術(shù)可以反映細(xì)胞之間的實(shí)時(shí)接觸信息，大大提升了細(xì)胞間相互作用的研究水平和精度。但值得注意的是，當(dāng)細(xì)胞分開后，synNotch停止激活，細(xì)胞膜上的tTA將不再入核；同時(shí)，由于蛋白代謝，游離的tTA以及報(bào)告蛋白會(huì)逐漸減少，受體細(xì)胞將很快失去報(bào)告蛋白標(biāo)記。那么，如何實(shí)現(xiàn)體內(nèi)鄰近細(xì)胞的永久追蹤呢？

為了讓synNotch的瞬時(shí)激活轉(zhuǎn)變?yōu)橛谰眯缘倪z傳改變，研究人員引入了Cre-loxP同源重組系統(tǒng)。當(dāng)Cre-loxP發(fā)生同源重組后，兩個(gè)loxP之間的終止序列被切除，報(bào)告基因可以永久性地表達(dá)。他們在synNotch技術(shù)中引入tetO-Cre;R26-tdT，實(shí)現(xiàn)永久記錄細(xì)胞之間的相互作用。與tetO-nLacZ和tetO-tdT類似，tetO-Cre工具小鼠受到tTA的調(diào)控，表達(dá)出Cre重組酶。受體和配體細(xì)胞相互接觸后激活synNotch信號通路，誘導(dǎo)受體細(xì)胞表達(dá)Cre，從而使受體細(xì)胞被永久示蹤，該技術(shù)稱作鄰近細(xì)胞遺傳示蹤技術(shù)。他們以心肌細(xì)胞作為配體細(xì)胞（Tnnt2-mGFP），內(nèi)皮細(xì)胞作為受體細(xì)胞（Cdh5-αGFP-N-tTA），利用該技術(shù)對與心肌細(xì)胞接觸過的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行永久示蹤。在小鼠胚胎早期，心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞與心肌細(xì)胞緊密接觸；從胚胎9.0天到出生后，心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞來源的房室墊逐漸重塑形成心臟瓣膜，瓣膜中心內(nèi)膜來源的間充質(zhì)細(xì)胞不僅遠(yuǎn)離心肌細(xì)胞，而且也不表達(dá)Cdh5基因，但結(jié)果顯示，這些間充質(zhì)細(xì)胞持續(xù)表達(dá)tdTomato，證明曾經(jīng)接觸過心肌細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞及其子代細(xì)胞都經(jīng)歷過Cre-loxP介導(dǎo)的遺傳操作，被永久性示蹤標(biāo)記。此外，他們發(fā)現(xiàn)示蹤的心臟內(nèi)皮細(xì)胞在早期胚胎發(fā)育過程中會(huì)遷移到肝臟，轉(zhuǎn)變成為肝臟特有的肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞。

細(xì)胞間的相互作用還與各種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。以腫瘤為例，在腫瘤發(fā)生過程中，腫瘤細(xì)胞招募周圍組織中的血管遷移至腫瘤，受到腫瘤環(huán)境影響，腫瘤血管與正常血管相比具有顯著差異。研究人員利用新開發(fā)的鄰近細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)研究腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用。他們將過表達(dá)mGFP的TC-1腫瘤細(xì)胞系皮下移植到受體小鼠Cdh5-αGFP-N-tTA;tetO-Cre;R26-tdT中。研究人員觀察到幾乎全部的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞都被標(biāo)記上tdTomato，并通過長時(shí)程追蹤發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)遷移到腫瘤外包膜，這部分腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞仍然具有典型的轉(zhuǎn)移和浸潤、促血管生成以及炎癥反應(yīng)等特征，為腫瘤的研究治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。

基于以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為了拓展鄰近細(xì)胞遺傳學(xué)的應(yīng)用范圍，研究人員構(gòu)建了由Cre重組酶誘導(dǎo)表達(dá)synNotch配體的小鼠R26-mGFP。搭配特定細(xì)胞類型的Cre小鼠品系，通過Cre-LoxP重組，特異性地使該類型細(xì)胞表達(dá)mGFP，成為配體細(xì)胞。同時(shí)，研究人員也構(gòu)建了由Cre誘導(dǎo)表達(dá)synNotch受體的小鼠H11-αGFP-N-tTA，結(jié)合Cre小鼠使特定類型細(xì)胞表達(dá)αGFP-N-tTA，成為受體細(xì)胞。

更進(jìn)一步地，研究人員對該系統(tǒng)進(jìn)行改造優(yōu)化以提高其可用性，他們將序列tetO-rox-stop-rox-tdT-insulator-CAG-loxP-αGFP-N-tTA-pA-loxP-mGFP插入到小鼠基因組Tigre位點(diǎn)，構(gòu)建了Tigre-synNotch小鼠。在該小鼠中，所有細(xì)胞都會(huì)表達(dá)αGFP-N-tTA，成為受體細(xì)胞。當(dāng)搭配特定Cre小鼠時(shí)，Cre重組酶會(huì)在基因組上切掉αGFP-N-tTA-pA序列，使Cre陽性的細(xì)胞表達(dá)mGFP，成為配體細(xì)胞。由于所有Cre陰性的細(xì)胞保持著受體細(xì)胞的狀態(tài)，因此，研究人員能夠利用Tigre-synNotch標(biāo)記與特定細(xì)胞接觸的所有其他細(xì)胞。

綜上，該研究的亮點(diǎn)在于開發(fā)了可以捕捉體內(nèi)細(xì)胞間相互作用并能夠永久追蹤?quán)徑?xì)胞的創(chuàng)新研究工具——鄰近細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，該技術(shù)具有較高的可調(diào)控性、簡易性和普適性，以一種全新的視角直觀展現(xiàn)了體內(nèi)細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)相互作用。這一新技術(shù)突破了傳統(tǒng)的細(xì)胞示蹤方法，將體內(nèi)細(xì)胞示蹤和遺傳學(xué)研究提升到了一個(gè)新的維度，為發(fā)育生物學(xué)、干細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)和腫瘤學(xué)等眾多領(lǐng)域研究提供了新的研究思路和強(qiáng)大技術(shù)支撐。

分子細(xì)胞卓越中心周斌研究組博士后張少華和副研究員趙歡博士為該論文的共同第一作者，周斌研究員為該論文通訊作者。該工作得到了美國加州大學(xué)舊金山分校Rong A. Wang教授、西湖大學(xué)何靈娟研究員的大力支持。該工作也得到分子細(xì)胞卓越中心動(dòng)物平臺和細(xì)胞分析技術(shù)平臺以及上海南方模式生物公司的大力支持，并得到來自中科院、基金委、科技部、上海市科委等部門的經(jīng)費(fèi)支持。

文章鏈接：https://doi.org/10.1126/science.abo5503

圖：（i）小鼠胚胎中心肌細(xì)胞表達(dá)synNotch配體（綠色），內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)synNotch受體（紫色）。（ii-iv）新生小鼠心臟中，表達(dá)synNocth配體的心肌細(xì)胞（綠色，ii），利用鄰近細(xì)胞遺傳標(biāo)記技術(shù)捕捉實(shí)時(shí)接觸心肌細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞（藍(lán)色，iii），利用鄰近細(xì)胞遺傳示蹤技術(shù)追蹤接觸過心肌細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞（紅色，iv）。

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