小膠質(zhì)細胞是位于大腦中的巨噬細胞，主要負責中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 的免疫防御，對維持大腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)有著重要作用。

然而，由于缺乏合適的研究工具，當前的研究方法很難區(qū)分小膠質(zhì)細胞及腦內(nèi)其它巨噬細胞，因此，人們對小膠質(zhì)細胞功能機制的深入研究受到了一定的限制。

之所以很難區(qū)分小膠質(zhì)細胞及腦內(nèi)其它巨噬細胞，是因為這些巨噬細胞同源，許多標記物都相同，如整合素 α M (ITGAM/CD11b)、表面糖蛋白 F4/80、造血標志物CD45、溶酶體蛋白CD68、離子鈣接頭分子（Iba）-1， Cx3趨化因子受體1（Cx3cr1）、MER原癌基因酪氨酸蛋白激酶（MerTK）等。

事實上，早前出現(xiàn)的Cx3cr1-Cre和Cx3cr1-CrERT2品系都是標記所有CNS巨噬細胞，并不能區(qū)分小膠質(zhì)細胞和腦內(nèi)其它巨噬細胞。

因此，使用Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CrERT2品系通常將CNS中所有巨噬細胞的混合體作為整體進行評估，而不是只針對小膠質(zhì)細胞這一類進行研究。

此外，現(xiàn)有的轉基因品系如Sall1-GFP、Sall1-CreERT2、Cx3cr1-GFP、Cx3cr1-Cre或Cx3cr1-CreERT2通常是替代性敲入策略產(chǎn)生的，即表達外源性敲入的序列，內(nèi)源性基因不表達，但是該類策略有可能會影響小膠質(zhì)細胞的表型，因此，迫切需要新的基因工具來對小膠質(zhì)細胞進行研究。

為此，南模生物自主研發(fā)，構建了一種新的小膠質(zhì)細胞基因靶向模型，Tmem119-CreERT2工具小鼠，該小鼠可用于特異性研究小膠質(zhì)細胞的功能。

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早在2016年，斯坦福大學醫(yī)學院Mariko L. Bennett等人在頂尖雜志PNAS發(fā)表了一篇文章，對小膠質(zhì)細胞的特異性標志物進行了深入探究。

作者篩選出7個（Tmem119、Fcrls、P2ry12、P2ry13、Gpr34、Gpr84、Il1a)?候選基因，通過原位雜交，發(fā)現(xiàn)TMEM119特異性在鼠源和人源的小膠質(zhì)細胞上大量表達（Fig1），在脈絡膜叢和腦膜巨噬細胞，血管周圍細胞中均沒有表達。

另外，qPCR結果顯示TMEM119在CNS?CD45+細胞中高表達，在骨髓、脾臟、肝臟和血液中不高表達。

所有這些數(shù)據(jù)表明：TMEM119在小膠質(zhì)細胞中高表達且僅限于小膠質(zhì)細胞，TMEM119確實可以作為小膠質(zhì)細胞高度特異性的marker。隨后，TMEM119抗體被廣泛用作免疫組化方法的金標準。

Fig1. 免疫熒光檢測TMEM119在小膠質(zhì)細胞中特異性表達。

2019年，Tobias Kaiser等通過CRISPR/Cas9技術插入2A-EGFP基因盒，使得TMEM119和EGFP的表達受到內(nèi)源性Tmem119基因的控制，利用免疫熒光染色、免疫熒光成像等技術對小鼠腦組織中表達EGFP的細胞進行分析，結果發(fā)現(xiàn)：除小膠質(zhì)細胞外，脈絡膜叢和腦膜巨噬細胞，血管周圍細胞中均沒有EGFP的表達（Fig2. A-F）。

為了進一步驗證EGFP在小膠質(zhì)細胞中的特異性，作者使用了流式細胞術，通過檢測CD45+EGFP+細胞，他們確定99.6% 的細胞是對應于小膠質(zhì)細胞的CD11b+CD45lo細胞(Fig2. H)。對2212個非小膠質(zhì)細胞CD11b+CD45int/hi進一步檢測，發(fā)現(xiàn)僅有153個細胞表達EGFP(6.9%)( Fig2. G-I)。

綜上數(shù)據(jù)表明，Tmem119-EGFP可以特異性的區(qū)分小膠質(zhì)細胞和腦內(nèi)其他巨噬細胞。

Fig2. Tmem119-EGFP 可特異性區(qū)分小膠質(zhì)細胞及腦內(nèi)其它巨噬細胞。

此外，Tobias Kaiser等科學家還證明Tmem119位點可被用于Tamoxifen誘導Cre介導的小膠質(zhì)細胞基因操作和小膠質(zhì)細胞的譜系追蹤，且可排除其它巨噬細胞的影響。

作者將Tmem119-CreERT2小鼠與Ai14報告小鼠進行雜交，經(jīng)Tamoxifen處理后，對小鼠進行免疫熒光染色。

結果發(fā)現(xiàn)，Tamoxifen誘導后，IBA1標記的小膠質(zhì)細胞會表達紅色熒光 (Fig3. B-D)，未經(jīng)Tamoxifen誘導的小鼠則沒有tdTomato表達?(Fig3.E-G)。

另外研究還發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其他主要細胞類型，如少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中都沒有tdTomato表達?(Fig3.H-J)。

Fig3. Tmem119-CreERT2小鼠在小膠質(zhì)細胞中具有高效的重組效率。

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我們利用CRISPR/Cas9技術在Tmem119基因的終止密碼子前插入了2A-CreERT2基因盒，使得Cre重組酶具有Tmem119啟動子特異性，且需要tamoxifen的存在才能激活。

通過將Tmem119- CreERT2與熒光報告基因小鼠基因交配發(fā)現(xiàn)，Tamoxifen誘導的Tmem119- CreERT2系可以在很長一段時間內(nèi)對小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳修飾。

為了評估Tmem119-CreERT2小鼠誘導后在小膠質(zhì)細胞中是否有Cre活性，我們將Tmem119-CreERT2小鼠與R26-LSL-tdTomato報告小鼠進行雜交。

實驗表明：無Tamoxifen誘導的對照組中，檢測不到tdTomato的表達，只有經(jīng)Tamoxifen誘導后，小膠質(zhì)細胞才能夠表達tdTomato（Fig4. A-B）。

此外，在少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中都檢測不到tdTomato表達（Fig4.?C-D），該結果與已有報道的信息是相符的，提示該小鼠是研究小膠質(zhì)細胞研究的有力工具鼠。??

Fig4.?Tmem119-CreERT2小鼠在小膠質(zhì)細胞中具有高表達。

A. 經(jīng)Tamoxifen和玉米油分別處理，熒光檢測Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠中tdTomato的表達情況。

B. 熒光檢測Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠IBA1 陽性細胞中有tdTomato的表達。

C. 熒光檢測Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠小膠質(zhì)細胞（Tmem119，Tdtomato）與星形膠質(zhì)細胞（GFAP, green）共定位。

D. 熒光檢測Tmem119-CreER；R26-tdTomato小鼠小膠質(zhì)細胞（Tmem119，Tdtomato）與神經(jīng)元（NeuN, green）共定位。

（Scale bar=10μm Hippo: Hippocampus; Str: Striatum; Sn: Substantia nigra.)

綜上所述， Tmem119在小膠質(zhì)細胞高度特異性表達的特性，使其可作為區(qū)別于遺傳特征相近的CNS髓細胞和外周血中的髓細胞的marker基因/

本文構建的可誘導的Tmem119-CreERT2是一個很好的體內(nèi)模型，可以在特定的時間點對小膠質(zhì)細胞特異性基因進行研究，為探索小膠質(zhì)細胞開辟了新的途徑。

目前該小鼠是活體供應的狀態(tài)，歡迎研究小膠質(zhì)細胞功能的老師咨詢及訂購。