解決稀缺困境丨罕見病小鼠模型來啦！
罕見病，是指發(fā)病率很低、很少見的疾病，一般為慢性、嚴(yán)重的疾病，常常危及生命。罕見病并非特指某種疾病，而是對(duì)一大類散落在各個(gè)疾病系統(tǒng)的罕見疾病的統(tǒng)稱。
根據(jù)美國(guó)食品與藥物管理局（FDA）的統(tǒng)計(jì)，全球已知的罕見病約有7,000 多種，占人類疾病數(shù)量的10%。全球罕見病患者已超過2.5 億，患者中近50% 為兒童。已知的7,000 多種罕見病中，僅有不到10% 的疾病有已批準(zhǔn)的治療藥物或方案。但大部分罕見病由于與其他疾病藥物相比，研發(fā)過程更為艱辛，患者人數(shù)少，臨床試驗(yàn)難度更高，因此至今仍直接威脅患者生命或嚴(yán)重影響生存質(zhì)量。
面對(duì)罕見病患者數(shù)量少，研究樣本稀缺，臨床試驗(yàn)難度高的困境，合適的動(dòng)物模型就顯得尤為重要了。穩(wěn)定可靠的罕見病動(dòng)物模型的建立與供應(yīng)，對(duì)于罕見病的發(fā)病機(jī)制研究、藥物靶點(diǎn)研究以及治療效果評(píng)價(jià)等方面都具有不可估計(jì)的潛力。
01罕見病小鼠模型助力發(fā)病機(jī)制研究
示例：Fgf23-R176Q基因突變小鼠
常染色體顯性遺傳性低磷佝僂病（ADHR）是由成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（FGF23）第176或179位氨基酸的雜合點(diǎn)突變引起的，使得體內(nèi)FGF23水平持續(xù)增高，尿磷排泄增加，血磷下降。ADHR的臨床表現(xiàn)為，兒童期發(fā)病者多表現(xiàn)為下肢畸形、身材矮小，成人或青少年期發(fā)病者多表現(xiàn)為骨痛、乏力、骨質(zhì)軟化。
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將Fgf23-R176Q基因突變小鼠（ADHR）與野生型WT小鼠置于對(duì)照或低鐵飲食中，發(fā)現(xiàn)接受低鐵飲食的WT和ADHR小鼠的骨Fgf23 mRNA均顯著升高，相比之下，低鐵飲食的ADHR小鼠伴有低磷酸鹽血癥性骨軟化癥（Fig.1）。這些發(fā)現(xiàn)表明ADHR可能是一種通過基因與環(huán)境相互作用產(chǎn)生的疾病，F(xiàn)gf23突變和鐵缺乏的共同存在可導(dǎo)致ADHR[1]。
Fig.1?鐵離子缺失導(dǎo)致Fgf23突變小鼠出現(xiàn)ADHR癥狀
基于以上研究，因此在2019年的一項(xiàng)臨床研究中，對(duì)ADHR患者進(jìn)行了為期12個(gè)月的口服鐵替代治療的前瞻性試驗(yàn)性臨床試驗(yàn)。在鐵治療期間，基線低磷血癥的三名受試者的血清磷均正?；?，癥狀明顯改善，并且可以停用骨化三醇和磷酸鹽[2]。
02罕見病小鼠模型為疾病診療提供理想模型
示例：G6pc-CKO小鼠
糖原累積?。òá裥汀ⅱ蛐停┚浅Ｈ旧w隱性遺傳病。其中，糖原貯積病Ia型（GSD-Ia）是由葡萄糖6磷酸酶催化亞基基因（G6PC）功能缺失突變引起的。典型表現(xiàn)為嬰幼兒期起病的肝臟腫大、生長(zhǎng)發(fā)育落后、空腹低血糖、高脂血癥、高尿酸血癥和高乳酸血癥等。GSD-Ia并發(fā)癥包括具有肝細(xì)胞癌（HCC）形成風(fēng)險(xiǎn)的肝細(xì)胞腺瘤（HCA）。
1996年，首次創(chuàng)建了G6pc敲除小鼠模擬人類GSD-Ia型患者的病理生理。這些小鼠表現(xiàn)出非常嚴(yán)重的葡萄糖穩(wěn)態(tài)平衡表型，斷奶后難以存活[3]。2006年，研究人員對(duì)2周齡的G6pc敲除小鼠給予編碼G6Pase的腺相關(guān)病毒（AAV）載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)治療的G6pc敲除小鼠僅存活2周相比，載體給藥后生存期延長(zhǎng)至7個(gè)月[4]。
但是G6pc敲除鼠的生存期較短，在藥物治療研究中窗口期較短，因此為藥物研發(fā)過程帶來一定難度。目前已經(jīng)有研究者建立了肝臟特異性G6pc敲除小鼠模型（G6pc-flox與Alb-Cre交配），LS?G6pc-/-小鼠，作為研究肝臟的長(zhǎng)期病理生理學(xué)和潛在治療策略（例如細(xì)胞療法）的替代動(dòng)物模型（Fig.2）[5,6]。最近的一項(xiàng)研究已經(jīng)利用LS?G6pc-/-小鼠探索了使用外泌體microRNA（Exo-miRs）作為疾病標(biāo)志物的可能性[7]。
Fig.2?肝特異性G6pc缺陷小鼠發(fā)生肝細(xì)胞腺瘤和癌
03罕見病小鼠系列模型來啦
2018年5月，國(guó)家五部委聯(lián)合發(fā)布了《第一批罕見病目錄》，包含121 個(gè)病種，這是中國(guó)罕見病事業(yè)發(fā)展史上的里程碑事件，標(biāo)志著國(guó)家解決罕見病患者用藥可及問題的決心[8]。
南模生物為助力罕見病研究，自主研發(fā)了一系列罕見病小鼠模型，以下是品系列表：
部分模型驗(yàn)證數(shù)據(jù)
模型1：早衰樣核纖層蛋白病小鼠模型
2020年5月，首款用于治療早衰癥和早衰樣核纖層蛋白病的藥物Zokinvy提交申請(qǐng)，獲得FDA優(yōu)先審查，該藥物將死亡風(fēng)險(xiǎn)降低88%！在全球范圍內(nèi)，早衰樣核纖層蛋白病的發(fā)病率可能高于早衰癥。早衰樣核纖層蛋白?。╬rogeroid laminopathies）是由核纖層蛋白A（lamin A）和/或Zmpste24基因的一系列突變引起的加速衰老的遺傳，這些基因突變會(huì)導(dǎo)致與早衰癥有重疊的疾病表現(xiàn)。
南模生物構(gòu)建Zmpste24敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠成長(zhǎng)遲緩，有明顯的運(yùn)動(dòng)障礙，并且壽命縮短，是一個(gè)理想的早衰樣核纖層蛋白病小鼠模型（Fig.3）。
Fig.3?Zmpste24敲除鼠的部分表型
模型2：血友病小鼠模型
血友病為一組遺傳性凝血功能障礙的出血性疾病，其共同的特征是活性凝血活酶生成障礙，凝血時(shí)間延長(zhǎng)，終身具有輕微創(chuàng)傷后出血傾向，重癥患者沒有明顯外傷也可發(fā)生“自發(fā)性”出血。根據(jù)凝血因子差異可分為由FVIII（F8）凝血因子功能異常導(dǎo)致的血友病A與FIX（F9）凝血因子異常所致的血友病B。
為了滿足血友病治療研究，南模生物自主研發(fā)了F8與F9基因敲除小鼠模型！
F8基因敲除小鼠有明確的血友病A癥狀，是在整體動(dòng)物水平研究血友病A發(fā)病機(jī)制和藥物篩選的理想動(dòng)物模型。
Fig.4 F8敲除鼠的F8活性以及APTT（凝血活酶時(shí)間）檢測(cè)
F9基因敲除小鼠是血友病B治療藥物的篩選和評(píng)價(jià)及血友病B基因治療的理想動(dòng)物模型。
Fig.5 F9敲除鼠肝組織中F9基因的表達(dá)以及血漿中F9蛋白的濃度
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模型3：杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良癥模型
杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良癥模型是一種性聯(lián)隱性遺傳病，又名為假性肥大型肌肉萎縮癥，為癥狀最嚴(yán)重的肌肉萎縮癥。由于基因突變?nèi)毕輰?dǎo)致肌肉細(xì)胞不能正常產(chǎn)生一種稱為Dystrophin的蛋白質(zhì)，會(huì)使鈣離子滲入細(xì)胞，引發(fā)瀑布反應(yīng)，導(dǎo)致患者全身肌肉無力，又因肌肉細(xì)胞內(nèi)缺少Dystrophin，導(dǎo)致細(xì)胞組織肌肉纖維變得無力且脆弱，經(jīng)長(zhǎng)期的伸展后該缺失肌肉細(xì)胞組織將產(chǎn)生機(jī)械性傷害等等因素而破壞，最終導(dǎo)致肌肉細(xì)胞死亡。
南模生物構(gòu)建了Dmd基因突變小鼠模型Dmd-(c.C2983T），發(fā)現(xiàn)該小鼠抓力顯著降低，并且骨骼肌肌間隙變寬，肌纖維大小不一，細(xì)胞核聚集，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（Fig.6-7），提示該模型可作為研究杜興肌營(yíng)養(yǎng)不良癥的小鼠模型.
Fig.6 Dmd-(c.C2983T）突變鼠的HE染色
Fig.7 Dmd-(c.C2983T）突變鼠的肢體抓力測(cè)試
目前罕見病小鼠模型大多是活體供應(yīng)的狀態(tài)，歡迎咨詢及訂購(gòu)：
References
1. Farrow EG, Yu X, Summers LJ. et al. Iron deficiency drives an autosomal?dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) phenotype in fibroblast growth?factor-23 (Fgf23) knock-in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Nov15;108(46):E1146-55.
2. Imel EA, Liu Z, Coffman M. et al. Oral Iron Replacement Normalizes Fibroblast Growth Factor 23 in Iron-Deficient Patients With Autosomal Dominant Hypophosphatemic Rickets. J Bone Miner Res. 2020 Feb;35(2):231-238.
3. Lei KJ, Chen H, Pan CJ, etal. Glucose-6-phosphatase dependent substrate transport in the glycogen storage disease type-1a mouse. Nat Genet. 1996 Jun;13(2):203-9.
4. Koeberl DD, Sun BD, Damodaran TV, etal. Early, sustained efficacy of adeno-associated virus vector-mediated gene therapy in glycogen storage disease type Ia. Gene Ther. 2006 Sep;13(17):1281-9.
5. Resaz R, Vanni C, Segalerba D, etal. Development of hepatocellular adenomas and carcinomas in mice with liver-specific G6Pase-α deficiency. Dis Model Mech. 2014 Sep;7(9):1083-91.
6. Saeed A, Hoogerland JA, Wessel H, etal. Glycogen storage disease type 1a is associated with disturbed vitamin A metabolism and elevated serum retinol levels. Hum Mol Genet. 2020 Jan 15;29(2):264-273.
7. Resaz R, Cangelosi D, Morini M, et al. Circulating exosomal microRNAs as potential biomarkers of hepatic injury and inflammation in a murine model of glycogen storage disease type 1a. Dis Model Mech. 2020 Sep 18;13(9):dmm043364.
8、 中國(guó)罕見病藥物可及性報(bào)告（2019）
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