自2013年單細(xì)胞測序技術(shù)被Nature Methods雜志評為年度技術(shù)之后，已有數(shù)百篇CNS因此發(fā)表，單單在今年10月份就有至少48篇9分以上的文章見刊，這樣的“得分”成就，不得不讓人心動。

單細(xì)胞測序技術(shù)主要解決的問題是細(xì)胞異質(zhì)性的問題，其優(yōu)勢在于能夠避免Bulk樣本的均質(zhì)化掩蓋單細(xì)胞的異質(zhì)性。這類文章的研究思路一般是單細(xì)胞測序后獲得數(shù)據(jù)，通過細(xì)胞注釋，識別每一個細(xì)胞的特征，包括細(xì)胞類型、功能狀態(tài)等，后續(xù)進(jìn)行細(xì)胞群功能、基因功能、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、發(fā)育時序等分析，乃至尋找新的臨床標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

然而單細(xì)胞測序文章“井噴”的現(xiàn)在，僅僅是測序后進(jìn)行細(xì)胞注釋、繪制圖譜這樣的內(nèi)容只能發(fā)表5分左右的文章，在更高水平的文章中，細(xì)胞注釋圖基本只能作為文章中的Fig.1（圖1）出現(xiàn)。有時甚至遇到剛拿到測序數(shù)據(jù)，別人同主題文章已經(jīng)online的情況。

圖1 小鼠腎臟細(xì)胞注釋圖譜示例

那有了單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，如何出其不意，發(fā)表高水平文章，沖擊CNS，走上人生巔峰呢？用好基因修飾小鼠是您的不二選擇。

所謂基因修飾小鼠是指目的基因被編輯后的小鼠模型，可以達(dá)到針對目的基因敲除，過表達(dá)，人源化，或敲入修飾元件的目的，因此可以用于對基因功能和細(xì)胞群生理作用的進(jìn)一步探究。

綜合多篇已發(fā)表高水平文章，不難發(fā)現(xiàn)，通過單細(xì)胞測序可以獲得新的細(xì)胞群及其特異的marker基因，接下來，一方面可以利用基于基因修飾技術(shù)的譜系示蹤小鼠在體內(nèi)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)對新細(xì)胞群的跟蹤分析（即細(xì)胞譜系示蹤研究方向）；另一方面，也可以通過基因修飾技術(shù)構(gòu)建條件性基因敲除或條件性細(xì)胞剔除小鼠進(jìn)行功能研究（即基因或細(xì)胞功能研究方向）。

以下，將用4個案例（兩個方向）來具體說明如何利用基因修飾小鼠來延續(xù)單細(xì)胞測序課題，希望能給大家?guī)硪稽c(diǎn)啟發(fā)。

01細(xì)胞譜系示蹤研究方向

案例1

【標(biāo)題】單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組鑒定了前列腺遠(yuǎn)端內(nèi)凹尖端一種獨(dú)特的管腔祖細(xì)胞類型

【期刊】Nature Genetics（IF=27）

【時間】2020-8-17

尋找去勢抵抗性前列腺干細(xì)胞的研究一直是前列腺研究領(lǐng)域懸而未決的重要科學(xué)問題。本文的研究人員通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了三群新的前列腺管腔細(xì)胞（Luminal-A、Luminal-B和Luminal-C），分析發(fā)現(xiàn)Luminal-C細(xì)胞具有前列腺干細(xì)胞的潛能，并特異表達(dá)Tacstd2、Ck4和Psca。

為了在體內(nèi)觀察這群細(xì)胞的分布及特性，研究人員構(gòu)建了兩種Luminal-C細(xì)胞特異的譜系示蹤小鼠（ Ck4^CreERT2/+ ; Rosa26^tdTomato/+ 和 Psca^CreERT2/+; Rosa26^EYFP/+ )（南模生物提供），進(jìn)一步確認(rèn)了Luminal-C細(xì)胞的定位和分布。本文建立的譜系示蹤小鼠即是在marker基因啟動子下表達(dá)CreERT重組酶，并與含有flox-stop小鼠交配，在Tamoxifen誘導(dǎo)重組后獲得特異性表達(dá)熒光的小鼠。

圖2 Ck4-Cre鼠的構(gòu)建和誘導(dǎo)

接著研究人員通過誘導(dǎo)前列腺組織再生，追蹤Luminal-C細(xì)胞參與的生理活動，發(fā)現(xiàn)Luminal-C細(xì)胞通過自我更新和分化成Luminal-A和Luminal-B細(xì)胞的機(jī)制促進(jìn)前列腺組織的損傷修復(fù)。這些實(shí)驗(yàn)證明了這群Luminal-C細(xì)胞是前列腺的成體干細(xì)胞。

圖3 Luminal-C細(xì)胞參與前列腺組織的損傷修復(fù)和癌變

案例2

【標(biāo)題】通過Ms4a3表達(dá)追蹤單核細(xì)胞譜系演變

【期刊】Cell（IF=36.2）

【時間】2019-9-5

長期以來國際免疫學(xué)界關(guān)于單核-巨噬細(xì)胞來源和更新的不同學(xué)說有著較多的爭議，文章通過單核細(xì)胞前體特異性的遺傳學(xué)譜系示蹤模型，揭示了單核細(xì)胞（monocyte）在骨髓中的發(fā)育過程以及成體組織巨噬細(xì)胞（Tissue-residentmacrophage）的更新過程。

研究人員首先利用單細(xì)胞測序技術(shù)分析了骨髓中單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞前體，發(fā)現(xiàn)了在單核細(xì)胞前體中特異性表達(dá)的基因Ms4a3。研究人員構(gòu)建了Ms4a3^TdT，Ms4a3^Cre和Ms4a3^CreERT2小鼠（南模生物提供），通過流式分析表達(dá)tdTomato的細(xì)胞是否表達(dá)血系其他類別細(xì)胞的標(biāo)志物，追蹤Ms4a3⁺細(xì)胞的時空變化。

在此使用了3種常規(guī)的細(xì)胞標(biāo)記方法，第一種是直接將熒光蛋白偶聯(lián)在Ms4a3蛋白上，示蹤內(nèi)源性蛋白，另兩種基于Cre-loxP系統(tǒng)，在于帶有熒光蛋白的flox鼠交配后獲得表達(dá)熒光的蛋白的Ms4a3⁺細(xì)胞，其中CreERT2小鼠可以實(shí)現(xiàn)在特定時間產(chǎn)生熒光蛋白。

圖4 Ms4a3^TdT，Ms4a3^Cre和Ms4a3^CreERT2小鼠的構(gòu)建

該模型成為闡釋單核-巨噬細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵工具。通過這些遺傳學(xué)示蹤模型，研究人員詳細(xì)闡釋了單核細(xì)胞在骨髓中的發(fā)育過程。在骨髓中單核細(xì)胞可以通過“1）CMP→GMP→cMoP→單核細(xì)胞；2）CMP→MDP→單核細(xì)胞”這兩條途徑產(chǎn)生。

圖5 Ms4a3可作為單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的譜系示蹤marker基因

02?基因或細(xì)胞功能研究方向

案例3

【標(biāo)題】補(bǔ)體信號決定B細(xì)胞在化療誘導(dǎo)免疫中的相反作用

【期刊】Cell（IF=36.2）

【時間】2020-3-19

在該研究中，作者分別收集了乳腺癌患者接受新輔助化療前后的腫瘤組織，從4例配對的化療前后臨床標(biāo)本中，分別分離出總共998和1499個腫瘤浸潤B細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序。進(jìn)一步通過流式分析在另外的79對標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)在化療前腫瘤浸潤B細(xì)胞以IL-10⁺的細(xì)胞為主，化療后治療效果好的病人IL-10⁺腫瘤浸潤B細(xì)胞明顯減少，取而代之的是一群以ICOSL⁺CR2^highIL-10^-CD20⁺CD38⁺CD27⁺IgA^-IgD^-為特征的B細(xì)胞亞群。

進(jìn)一步對細(xì)胞亞群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤ICOSL+B細(xì)胞的數(shù)目與化療反應(yīng)性正相關(guān)，這群ICOSL⁺B細(xì)胞比起ICOSL^-B細(xì)胞更傾向于定位在化療后形成的三級淋巴樣結(jié)構(gòu)中，并且與T細(xì)胞直接接觸。

既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中ICOSL主要由髓系細(xì)胞表達(dá)，另一方面濾泡樹突狀細(xì)胞也表達(dá)CR2，如何特異檢測ICOSL和CR2在B細(xì)胞的作用呢？因此，作者構(gòu)建了ICOSL-flox 和CR2-flox 小鼠（南模生物提供），通過與CD19-Cre工具鼠雜交，特異敲除B細(xì)胞的ICOSL和CR2。利用該模型，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在化療藥物處理后，表面外翻的磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）能夠引發(fā)補(bǔ)體C3活化進(jìn)而通過CR2激活B細(xì)胞，使得B細(xì)胞表達(dá)ICOSL，誘導(dǎo)CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞分別向輔助T細(xì)胞（Th1）及細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）分化，從而促進(jìn)抗腫瘤免疫。

圖6 ICOSL⁺B細(xì)胞促進(jìn)抗腫瘤免疫

案例4

【標(biāo)題】Sca1⁺動脈血管干細(xì)胞產(chǎn)生新生平滑肌用于動脈修復(fù)和再生

【期刊】Cell Stem Cell（IF=20）

【時間】2020-3-19

長久以來，對于成體哺乳動物體內(nèi)是否存在Sca1⁺血管平滑肌干細(xì)胞及其在損傷中的作用，一直沒有出現(xiàn)直接的驗(yàn)證文章。在本項(xiàng)研究中，研究人員首先將獲得的小鼠股動脈細(xì)胞利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析發(fā)現(xiàn)Sca1主要表達(dá)在血管的內(nèi)皮細(xì)胞、血管外基質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等部位。接著研究人員利用Sca1-CreER譜系示蹤系統(tǒng)，通過免疫熒光染色和流式分析，發(fā)現(xiàn)在股動脈中Sca1主要標(biāo)記血管中的部分內(nèi)皮細(xì)胞，血管外側(cè)的PDGFRa和PDGFRb基質(zhì)細(xì)胞以及少量的脂肪細(xì)胞，不標(biāo)記血管平滑肌細(xì)胞。

圖7 研究人員構(gòu)建的細(xì)胞譜系示蹤小鼠、條件性細(xì)胞剔除小鼠和條件性基因敲除小鼠

那Sca1⁺細(xì)胞是否能分化為平滑肌細(xì)胞呢？研究人員構(gòu)建了兩種血管損失小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重?fù)p傷的情況下，利用Sca1-CreER譜系示蹤系統(tǒng)可以檢測到Sca1⁺細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為成熟的（SMA⁺SM22⁺SM-MHC⁺CNN1⁺）平滑肌細(xì)胞。由于血管中的Sca1標(biāo)記了多種細(xì)胞，科研人員利用多種Cre和Dre示蹤小鼠，發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重血管損傷模型中Sca1⁺ PDGFRa⁺細(xì)胞是可以轉(zhuǎn)分化為平滑肌細(xì)胞，而其它類型細(xì)胞不可以。

最后，研究人員建立了R26-DTR小鼠和YAP^fl/fl小鼠發(fā)現(xiàn)，在特異性剔除Scal⁺細(xì)胞后，或者敲除Scal⁺細(xì)胞中的YAP基因，都會減少分化的平滑肌細(xì)胞。這項(xiàng)研究證明Sca1⁺PDGFRa⁺細(xì)胞具有轉(zhuǎn)分化潛能，同時闡明YAP基因在轉(zhuǎn)分化中起到了重要的作用，為血管損傷重塑研究提供了新的研究方向及理論基礎(chǔ)。

綜上所述，單細(xì)胞測序技術(shù)是為了在更高分辨率的細(xì)胞水平上的研究，歸根到底仍然是需要聚焦到一個marker基因，或者是表達(dá)這個marker基因的細(xì)胞群上，而通過基因修飾小鼠，可以更加清楚和真實(shí)的記錄細(xì)胞和基因在體內(nèi)的特征和功能，高分文章也就手到擒來。

對于生信分析小白來說，尋找marker基因的過程，不甚友好，在此推薦兩個數(shù)據(jù)庫，Mouse cell atlas和Sc2disease。Mouse cell atlas是浙大郭國冀團(tuán)隊(duì)對小鼠近50種器官組織的40余萬個單細(xì)胞進(jìn)行了系統(tǒng)性的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析制作而成的小鼠細(xì)胞圖譜，而SC2disease是西北工業(yè)大學(xué)彭佳杰教授課題組開發(fā)建立的，包含目前已檢測的22種疾病的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在這兩個網(wǎng)站上直接搜索感興趣的組織、器官、疾病，可以輕松get特定細(xì)胞群的marker基因。

網(wǎng)址如下：

http://bis.zju.edu.cn/MCA/index.html

http://easybioai.com/sc2disease/

圖8 Mouse cell atlas(左)和Sc2disease（右）數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)示例

南模生物具有成熟的基因修飾小鼠制備平臺，歡迎大家前來定制你的專屬基因修飾小鼠，并可提供超過200種自主產(chǎn)權(quán)Cre及熒光工具鼠和500余種自主產(chǎn)權(quán)成品Flox小鼠，有效縮短您的實(shí)驗(yàn)周期。

Reference

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