近年來(lái)，熒光蛋白（Fluorescent proteins，F(xiàn)Ps，圖1）在生物研究領(lǐng)域中的應(yīng)用呈爆炸式增長(zhǎng)。小鼠是目前研究人類基因功能最重要的模式動(dòng)物，將熒光蛋白表達(dá)元件敲入到小鼠基因組中對(duì)目的基因進(jìn)行標(biāo)記和示蹤是較為普遍的做法。

圖 1. 各色熒光蛋白生物成像圖

開(kāi)篇我們先了解下這些熒光蛋白由何而來(lái)。

1962年，維多利亞水母GFP首次被發(fā)現(xiàn)，在1992年被成功克隆，并在1994年首次作為熒光標(biāo)記用于體內(nèi)標(biāo)記。

此后，水母衍生GFP被改造為藍(lán)色（BFP）、青色（CFP）和黃色（YFP）突變體。

此外人們也陸續(xù)鑒定了來(lái)自其他物種的熒光蛋白，從而將其進(jìn)一步擴(kuò)展至橙色，紅色和遠(yuǎn)紅外光譜區(qū)（圖2）。

圖 2 熒光蛋白發(fā)展史 (A) 該領(lǐng)域階段性成果時(shí)間表。（B）FPs的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。在培養(yǎng)皿上接種表達(dá)FPs的細(xì)菌，并用A型紫外線照射。

常用的熒光蛋白種類繁多，會(huì)使研究者陷入選擇困難的境地，小編也經(jīng)常收到客戶關(guān)于熒光蛋白選擇的咨詢，比如哪個(gè)最亮，在選擇時(shí)需要考慮哪些因素等……

今天，讓小編用最短的時(shí)間，教你如何在生物實(shí)驗(yàn)中玩轉(zhuǎn)熒光蛋白。?

你真的了解熒光蛋白嗎？??

熒光蛋白的發(fā)光原理在于其發(fā)色基團(tuán)經(jīng)一定波長(zhǎng)的光（激發(fā)光）照射后被激活，并將能量以光能形式釋放，這時(shí)我們就能在熒光顯微鏡下看到日思夜想的熒光色啦！

但由于能量不能全以光的形式輻射出來(lái)，所以熒光蛋白的發(fā)射光（熒光）的波長(zhǎng)比激發(fā)光長(zhǎng)。

那么我們是怎么將熒光蛋白分類的呢？通常，人們按發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)分類并定義其顏色（表1）。

表 1. 熒光蛋白顏色分類表

同時(shí)呢，小編為大家整理了目前最通用的一些熒光蛋白（表2）。

通用熒光蛋白

表 2. 通用熒光蛋白參數(shù)表

RFPs（紅色熒光蛋白）：?

• mCherry具有優(yōu)異光穩(wěn)定性，是最通用紅色單體（但融合表達(dá)時(shí)有較弱的齊聚效應(yīng)）

• tdTomato具有mCherry相同的光穩(wěn)定性，亮度更強(qiáng)，是追蹤表達(dá)水平的理想選擇，但為串聯(lián)二聚體，可以在融合標(biāo)簽大小不干擾蛋白質(zhì)功能的情況下使用

• mStrawberry是最亮的紅色單體，但光穩(wěn)定性要弱于mCherry

• DsRed是細(xì)胞毒性最小的RFP

• mApple在蛋白的融合表達(dá)中是mCherry理想的替代物，但其光穩(wěn)定性要遠(yuǎn)弱于mCherry

• mKate2從參數(shù)方面考量是綜合亮度、光穩(wěn)定性和齊聚性的最佳RFP，但目前報(bào)道相對(duì)較少

OFPs（橙色熒光蛋白）：

• mOrange是最亮的橙色單體

YFPs（黃色熒光蛋白）：

• YPet具有極高的光穩(wěn)定性且成熟快,亮度極高

• mVenus是亮度極高的黃色單體

GFPs（綠色熒光蛋白）：

• EGFP是目前適用范圍最廣的FP，綜合多個(gè)優(yōu)勢(shì)屬性

CFPs（青色熒光蛋白）：

• mTurquoise是最亮的青色單體

• CyPet是最穩(wěn)定的CFP

BFPs（藍(lán)色熒光蛋白）：

• mTagBFP2是最穩(wěn)定，成熟極快、亮度極亮的藍(lán)色單體

熒光蛋白選擇八要素? ?

了解FP基本信息后，我們?cè)撊绾卧诿Ｃ晒獾鞍祝‵Ps）中縮小選取范圍呢？我們需要考慮以下八大要素：

• 激發(fā)波與發(fā)射波——我們選擇的光學(xué)系統(tǒng)需能夠有激發(fā)FP合適的激發(fā)光，并同時(shí)有檢測(cè)FP發(fā)射光的合適通道

• 齊聚度——融合表達(dá)時(shí)，選擇易齊聚的FP可能會(huì)影響其融合蛋白的生物學(xué)功能或定位，此時(shí)應(yīng)盡量選擇單體FP

• 亮度——選擇足夠亮的FP才能提供足夠信號(hào)以便檢測(cè)和成像

• 光穩(wěn)定性--FP應(yīng)具有足夠的光穩(wěn)定性以使其穩(wěn)定成像

• 成熟時(shí)間--FP正確折疊并形成發(fā)色基團(tuán)所需的時(shí)間

• pH穩(wěn)定性--某些FP隨著pH的變化會(huì)改變熒光強(qiáng)度，可用于檢測(cè)pH變化/胞吐作用

• 分子氧--許多FP上的發(fā)色基團(tuán)成熟需要氧氣，因此該類FP不能在缺氧環(huán)境使用

• 溫度--FP的成熟時(shí)間和熒光強(qiáng)度會(huì)受到溫度的影響，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)溫度環(huán)境選擇FP

有了上文提到的八要素評(píng)價(jià)體系后，我們就該考慮在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中如何運(yùn)用這些熒光蛋白。

如何運(yùn)用熒光蛋白? ?

根據(jù)FP與目標(biāo)蛋白連接與否，可將實(shí)驗(yàn)分為兩類：非融合表達(dá)與融合表達(dá)。

非融合表達(dá)：常用于追蹤目的基因表達(dá)水平（圖3），需要著重考慮FP亮度、光穩(wěn)定性、環(huán)境敏感度等要素。

圖3. 熒光蛋白非融合表達(dá)示意圖

例如，有研究者利用Myh6基因啟動(dòng)子構(gòu)建了心肌細(xì)胞特異性表達(dá)Cas9的轉(zhuǎn)基因小鼠，并在Cas9后加上2A-GFP或2A-TdTomato的熒光蛋白元件（圖4A），以使其作為報(bào)告基因來(lái)監(jiān)測(cè)Cas9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Myh6-Cas9-2A-GFP（圖4B）和Myh6-Cas9-2A-TdTomato（圖4C）小鼠的心肌細(xì)胞中均特異性高表達(dá)了Cas9蛋白。

圖4. Myh6-Cas9轉(zhuǎn)基因小鼠品系構(gòu)建。(A) Myh6-Cas9-2A-GFP和Myh6-Cas9-2A-TdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建策略。(B)熒光顯微鏡證實(shí)GFP在Myh6-Cas9-2A-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟中高表達(dá)，同窩陰性對(duì)照（左）。(C)熒光顯微鏡證實(shí)TdTomato在Myh6-Cas9-2A-TdTomato轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟中高表達(dá)，同窩陰性對(duì)照（左）。(D) Western blot證實(shí)在Myh6-Cas9-2A-GFP和Myh6-Cas9-2A-TdTomato小鼠中均有帶有Flag標(biāo)簽的Cas9蛋白表達(dá)。

融合表達(dá)：常用于目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位、遷移示蹤或蛋白互作探究（圖5）。融合表達(dá)中，選擇FP需要考慮的因素更為復(fù)雜，不合適的FP可能會(huì)影響融合目標(biāo)蛋白的定位和功能，因此FP的選擇將視具體情況而定。

那么，有沒(méi)有通用的設(shè)計(jì)思路呢？下面，讓小編帶大家整理一套簡(jiǎn)便的熒光融合蛋白（Fluorescent fusion protein, FFP）設(shè)計(jì)方案。

圖5. 熒光蛋白融合表達(dá)示意圖（以3’ 端融合為例）

Step 1 選擇目的蛋白與熒光蛋白的融合方式。依據(jù)目標(biāo)蛋白的功能與定位信號(hào)是否已知，可以分別實(shí)施以下兩個(gè)策略：

• 策略一（適用于目的蛋白的功能域和靶向域未知）：

為構(gòu)建出功能完善且針對(duì)性強(qiáng)的FFP，我們應(yīng)設(shè)計(jì)兩種結(jié)構(gòu)，分別將FP放在目標(biāo)蛋白的N端和C端。這是因?yàn)橛行┠康牡鞍椎恼郫B包括其N端或C端，若我們把FP放在目的蛋白折疊端，將觀察不到熒光信號(hào)。

此外，有些目的蛋白在翻譯后修飾過(guò)程中存在一端被剪切現(xiàn)象，如果熒光蛋白處于被剪切的一端，那么就不能獲得目的蛋白準(zhǔn)確的定位信息。

因此對(duì)于已知信息有限的新蛋白，建議構(gòu)建N端和C端兩種融合方式的細(xì)胞或小鼠以便后續(xù)確定最優(yōu)解。

• 策略二（適用于目的蛋白的功能域和靶向域已知）：

根據(jù)已知信息，將FP插入最佳位置（即FP不干擾靶向結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)折疊的位置）。

以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白（ERs）為例，ER蛋白通常包含兩個(gè)具有靶向信息的關(guān)鍵序列：N端的信號(hào)肽和C端的ER駐留信號(hào)序列。其中，信號(hào)肽對(duì)于新生肽靶向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中至關(guān)重要。因此，F(xiàn)P必須放置在信號(hào)序列之后，但是具體應(yīng)放在哪呢？

如果蛋白功能域位于C末端附近，則將FP置于信號(hào)序列之后比較合理（圖6A）。具體來(lái)說(shuō)，應(yīng)將FP置于預(yù)測(cè)的信號(hào)序列切割位點(diǎn)的下游2至10個(gè)氨基酸，以提高信號(hào)肽切割效率與FFP向ER轉(zhuǎn)運(yùn)的效率。

如果蛋白功能域靠近N端，則應(yīng)將FP置于C端附近（圖6B）。具體來(lái)說(shuō)，ER駐留信號(hào)序列是KDEL，可將FP置于KDEL序列前。

圖6 熒光融合蛋白(FFP)構(gòu)建示例。目標(biāo)蛋白序列中FP融合的優(yōu)選位點(diǎn)用笑臉表示。（A）ER蛋白包含N端信號(hào)肽（SP），靠近C端的功能域（FD）和C端駐留信號(hào)序列（KDEL）。將FP插入在SP之后，可最大程度減少干擾目的蛋白的功能。（B）ER蛋白包含N端信號(hào)肽（SP），靠近N端的功能域（FD）和C端駐留信號(hào)序列（KDEL）。將FP插入在KDEL之前，可最大程度減少干擾目的蛋白的功能。

Step 2選擇適合的FP進(jìn)行融合表達(dá)。我們需要重點(diǎn)考慮FP形成低聚物的概率（齊聚度），實(shí)際分子大小和蛋白質(zhì)電荷（大型或帶電的FP融合物可能會(huì)改變目標(biāo)蛋白的折疊與亞細(xì)胞定位）等。

例如，有研究人員將非單體型的EGFP與ER膜蛋白融合表達(dá)后發(fā)現(xiàn)EGFP的存在導(dǎo)致滑面ER形成了組織狀結(jié)構(gòu)，而單體型EGFP（mGFP）則沒(méi)有影響ER結(jié)構(gòu)（圖7A,B）；而將mRFP與膜蛋白融合表達(dá)時(shí)，在細(xì)胞中觀察到了鮮紅色的聚點(diǎn)狀信號(hào)，這是由于mRFP與膜蛋白的融合減少了該蛋白的旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散趨勢(shì)，從而形成了聚集體（圖7C）。

圖7 熒光蛋白與天然蛋白的融合可能會(huì)改變天然蛋白的正常定位模式，或?qū)е戮奂w的形成。（A）非單體化EGFP與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜蛋白的融合誘導(dǎo)了滑面ER組織狀結(jié)構(gòu)的形成。（B）單體化EGFP（mGFP）與相同蛋白質(zhì)的融合則不會(huì)顯著改變ER結(jié)構(gòu)。（C）Cos-7細(xì)胞表達(dá)兩種熒光融合蛋白（FFP），mGFP和mRFP均定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。但由mRFP標(biāo)記的蛋白產(chǎn)生的圖像顯現(xiàn)許多亮點(diǎn)信號(hào)，為mRFP聚集體。

Step 3 評(píng)估FFP的表達(dá)情況。在構(gòu)建FFP后，我們必須評(píng)估表達(dá)的FFP是否發(fā)熒光，是否以類似于細(xì)胞內(nèi)天然蛋白的模式定位（例如，通過(guò)將目的蛋白免疫熒光分布和熒光融合蛋白的熒光分布進(jìn)行對(duì)照），是否保留了天然蛋白質(zhì)的功能（由研究者自己的測(cè)定方法確定）。

熒光蛋白用于多色實(shí)驗(yàn)? ?

無(wú)論在融合表達(dá)還是非融合表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，我們時(shí)常會(huì)面臨需要選擇多個(gè)FP進(jìn)行共成像的實(shí)驗(yàn)需求，例如追蹤多基因表達(dá)水平、亞細(xì)胞定位、研究蛋白互作和細(xì)胞篩選等（圖8）。

圖8. 熒光蛋白用于多色實(shí)驗(yàn)

選擇FPs進(jìn)行多色實(shí)驗(yàn)時(shí)除了考慮上述提到的基本八要素，還要兼顧熒光蛋白的兼容性。其中，選擇兼容FPs遵守的原則是：選擇不同熒光的峰值激發(fā)波長(zhǎng)和峰值發(fā)射波長(zhǎng)都應(yīng)分開(kāi)50-60 nm以上。

例如，CFP（ex 430 nm / em 474 nm）和YFP（ex 514 nm / em 527 nm）可以一起成像，但CFP和GFP（ex 488 nm / em 507 nm）在顯示時(shí)會(huì)存在一些串?dāng)_。

目前一些比較常用的多色FPs組合：

雙熒光（綠-紅）：

• EGFP+mCherry,?

• EGFP+tdTomato

• EGFP+mKate2

雙熒光（青-黃）：

• CyPet+YPet

三熒光（藍(lán)綠紅/青黃紅）：

• mTagBFP2+EGFP+mCherry

• mTagBFP2+EGFP+tdTomato

• mTagBFP2+EGFP+mKate2

• CyPet+YPet+mCherry

• CyPet+YPet+mKate2

希望今天的干貨分享對(duì)每一位熒光蛋白的使用者有所幫助，在選擇熒光蛋白時(shí)，不再迷茫！

參考文獻(xiàn)：

1 Shaner, N C, Steinbach P A, Tsien R Y.?A guide to choosing fluorescent proteins[J]. Nature Methods, 2005，2(12), 905–909.?

2 Kremers G J , Gilbert S G , Cranfill P J , et al. Fluorescent proteins at a glance[J]. Journal of Cell Science, 2011, 124(2):157-60.

3 Carroll K J, Makarewich C A, McAnally J, et al.?A mouse model for adult cardiac-specific gene deletion with CRISPR/Cas9. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2015，113(2), 338–343.

4 Snapp E. Design and use of fluorescent fusion proteins in cell biology[J]. Current Protocols in Cell Biology, 2005, 27(1).

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