Cancer Cell | SIX1-KO小鼠助揭示腫瘤Warburg效應轉(zhuǎn)錄調(diào)控新機制
2018年2月16日，Cancer Cell 發(fā)表了軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所葉棋濃課題組的最新科研成果“Transcriptional Regulation of the Warburg Effect in Cancer by SIX1”，首次將miR-548a-3p/SIX1軸與Warburg效應和腫瘤生長聯(lián)系起來，并闡明了相關作用機制。
此項研究發(fā)現(xiàn)：
SIX1是新的Warburg 效應的關鍵轉(zhuǎn)錄因子
SIX1通過 HBO1和AIB1 增強 Warburg 效應
SIX1糖酵解功能直接被 microRNA548a-3p 抑制
miR-548a-3p / Six1軸調(diào)節(jié) Warburg 效應和腫瘤生長
研究背景
1956年，德國生理學家Warburg發(fā)現(xiàn)了腫瘤細胞的一種異常代謝。正常細胞中，葡萄糖會維持一個平衡狀態(tài)，在缺氧狀態(tài)時，葡萄糖會轉(zhuǎn)變?yōu)楸徇M而轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗?，當氧含量正常時，丙酮酸會進入線粒體，參與三羧酸循環(huán)并產(chǎn)生大量能量。而在癌細胞或其他高度增殖的細胞類型中，即使在常氧環(huán)境下，也不利用線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能，而是利用有氧糖酵解，在胞質(zhì)中酵解形成大量乳酸，這就是“Warburg效應”。
圖1. Myc和HIF-1調(diào)節(jié)葡萄糖代謝并刺激Warburg效應 （圖片來自Clin Cancer Res. 2009 Nov 1; 15(21): 6479–6483）。
以有氧糖酵解的形式在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，通過這種異常能量代謝，腫瘤細胞可以逃避正常的細胞凋亡程序，進行增殖和遷徙，因此Warburg效應是癌癥的一個重要標志，人們正在致力于研發(fā)針對Warburg效應的抗腫瘤藥物。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1a和c-Myc是Warburg效應的關鍵調(diào)節(jié)因子。Myc和HIF-1調(diào)節(jié)（上圖虛線表示）參與葡萄糖代謝的基因（葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut1，HK2，PKM2，LDHA和PDK1），有利于葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸（糖酵解）。Myc也通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白（SLC1A5）和谷氨酰胺酶（GLS）來刺激谷氨酰胺代謝。谷氨酰胺通過脫氨基作用變成α-酮戊二酸（α-KG），從而進入三羧酸循環(huán)，分解代謝成蘋果酸，被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)并轉(zhuǎn)化為丙酮酸，然后轉(zhuǎn)化為乳酸鹽（谷氨酰胺分解）。 PDH，丙酮酸脫氫酶。
不過，目前只有為數(shù)不多的幾個轉(zhuǎn)錄因子被報道參與了Warburg效應的調(diào)控，因此，人們對Warburg效應的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制仍知之甚少。
研究成果
SIX1是Warburg效應的關鍵轉(zhuǎn)錄因子
對SIX1穩(wěn)定敲低（KD）的乳腺癌細胞系ZR75-1及對照細胞系進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析以及Realtime RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)SIX1敲低后一系列糖酵解通路相關基因的表達發(fā)生了改變；類似的，SIX1敲除（KO）乳腺癌細胞系ZR75-1和SIX1 KD肝癌細胞系HepG2中糖酵解關鍵基因（GLUT1、HK2、PFKL、ALDOA、GAPDH、PGK1、ENO1、PKM2、LDHA）均顯著下調(diào)；重新表達SIX1可以拯救這些變化。同樣，在體內(nèi)實驗中，Six1 KO小鼠的成纖維細胞（MEFs）、胚胎、肝臟、小腸、肺組織中也檢測到相似結(jié)果（圖2）。提示了SIX1是調(diào)節(jié)糖酵解基因表達的關鍵因子。
圖2. Six1 KO小鼠胚胎及相關組織中糖酵解基因表達變化
SIX1通過結(jié)合SIX1響應元件促進糖酵解基因表達
早前研究提示SIX1的DNA結(jié)合位點具有TCAG/TG特征序列，而且SIX1直接與6個糖酵解基因（PFKL, ALDOA, PGK1, ENO1, PKM2和LDHA）的啟動子結(jié)合。因此，為研究SIX1如何調(diào)控糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄，利用熒光素酶報告基因系統(tǒng)，將受調(diào)控的糖酵解基因啟動子區(qū)域約3 kb的范圍內(nèi)含有SIX1結(jié)合位點的序列作為啟動子，觀察SIX1是否激活熒光素酶的表達（圖3A）。利用染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）也進一步證實了SIX1調(diào)控糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄是通過結(jié)合于它們的啟動子來實現(xiàn)的（圖3B）。
圖3. SIX1通過結(jié)合于帶有SIX1響應元件的啟動子來促進糖酵解基因表達
SIX1促進糖酵解基因轉(zhuǎn)錄主要是通過HBO1和AIB1介導的組蛋白乙?；?/strong>
基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控需要轉(zhuǎn)錄因子與組蛋白修飾酶的相互作用，而組蛋白乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄激活相關。利用免疫共沉淀（CoIP）結(jié)合質(zhì)譜法，篩選出兩個與SIX1相互作用的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶——HBO1與AIB1。利用HBO1和AIB1 KO、KD細胞系發(fā)現(xiàn)，HBO1 KO或KD細胞系中HK2, ALDOA, PGK1, ENO1 和 LDHA基因表達下調(diào)；AIB1 KO或KD細胞系中GLUT1, PFKL, ENO1, PKM2, 和 LDHA表達下調(diào)。重要的是，HBO1/AIB1 KO 或 KD后，SIX1對糖酵解基因的激活能力顯著降低或消失了。說明SIX1調(diào)控糖酵解基因的表達需通過與HBO1和AIB1的相互作用實現(xiàn)（圖4A-D）。
那么SIX1是如何通過HBO1和AIB1調(diào)控糖酵解基因的呢。通過ChIP實驗發(fā)現(xiàn)，SIX1促進糖酵解基因的轉(zhuǎn)錄是通過HBO1介導的H4K5乙酰化和AIB1介導的H3K4乙?；瘜崿F(xiàn)的（圖4H）。
圖4. SIX1促進糖酵解基因轉(zhuǎn)錄主要是通過HBO1和AIB1介導的組蛋白乙?；?/p>
SIX1被miR-548a-3p抑制，從而下調(diào)糖酵解基因表達
接下來要尋找上游調(diào)控SIX1的microRNAs。通過靶點預測，篩選到若干潛在的SIX1靶向miRNAs，其中只有miR-548a-3p能夠直接特異地抑制SIX1蛋白表達，并且降低受SIX1調(diào)控的糖酵解基因的表達。如果敲除SIX1基因，則miR-548a-3p對糖酵解基因的抑制作用也隨之消失。說明miR-548a-3p通過SIX抑制糖酵解基因的表達（圖5）。
圖5. miR-548a-3p通過SIX抑制糖酵解基因的表達
體外實驗表明miR-548a-3p/SIX1軸調(diào)節(jié)有氧糖酵解，影響腫瘤細胞擴增
miR-548a-3p mimics降低了腫瘤細胞的葡萄糖攝取、丙酮酸、乳酸及ATP水平、細胞外酸化率（ECAR）以及細胞有氧呼吸消耗速率（OCR）。SIX1敲除后，細胞的這些糖酵解表型變化消失，說明miR-548a-3p通過SIX1基因行使抑制糖酵解表型的功能。HBO1/AIB1 KO或KD后，SIX1對這些糖酵解表型的調(diào)節(jié)功能受到嚴重影響，說明SIX1需要依靠HBO1和AIB1來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。（圖6A-L）
miR-548a-3p mimics抑制了腫瘤細胞的增殖。糖酵解抑制劑（2-DG和3-BP）抑制了腫瘤細胞的增殖，降低了anti-miR-548a-3p 和 SIX1 對腫瘤細胞增殖的促進作用。（圖6M-O）
圖6. 體外實驗表明miR-548a-3p/SIX1軸調(diào)節(jié)有氧糖酵解，影響腫瘤細胞擴增
miR-548a-3p/SIX1軸在體內(nèi)同樣調(diào)控有氧糖酵解及腫瘤細胞擴增
在裸鼠異種移植瘤模型中，利用18FDG標記的小動物PET技術檢測腫瘤的糖攝取能力，發(fā)現(xiàn)miR-548a-3p通過SIX1調(diào)節(jié)糖攝取，而SIX1通過HBO1和AIB1發(fā)揮作用（圖7A-E）。通過糖酵解抑制劑2-DG或敲低LDHA糖酵解酶抑制糖酵解過程后，腫瘤生長和乳酸水平都顯著受到抑制。更重要的是，糖酵解抑制劑2-DG或敲低LDHA糖酵解酶消除了anti-miR-548a-3p和SIX1對腫瘤生長及乳酸水平的刺激作用，說明miR-548a-3p/SIX1軸介導的糖酵解對于腫瘤細胞的生長非常關鍵（圖7F-I）。
在Six1基因敲除小鼠胚胎中糖攝取及乳酸水平均顯著下降（圖7J）。而糖攝取增加的乳腺癌患者腫瘤樣本中的miR-548a-3p表達下調(diào)，SIX1表達上調(diào)（圖7K）。
圖7. miR-548a-3p/SIX1軸在體內(nèi)同樣調(diào)控有氧糖酵解及腫瘤細胞擴增
臨床腫瘤相關SIX1基因突變會促進糖酵解基因表達、有氧糖酵解以及腫瘤生長
臨床研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤中存在SIX1基因的Q177R突變。為研究該突變與糖酵解基因表達的關系，在SIX1基因敲除的腫瘤細胞系以及Six1基因敲除小鼠的MEF細胞中檢測糖酵解基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)相關糖酵解基因（HK2, GAPDH, PKM2 和 LDHA)表達上調(diào)。利用ChIP實驗證明SIX1（Q177R）突變后，其被招募到HK2和LDHA基因啟動子上的信號較野生型SIX1更強，對啟動子的激活能力更強。（圖8A-E）
SIX1（Q177R）突變體在體外實驗中增加了糖攝取、丙酮酸水平、乳酸產(chǎn)生以及ATP水平。SIX1敲除的腫瘤細胞在導入SIX1（Q177R）突變體后，與導入野生型SIX1相比，生長更為旺盛。SIX1（Q177R）突變后，HK2和LDHA的表達水平也更高。（圖8F-J）
圖8. 臨床腫瘤相關SIX1基因Q177R突變會促進糖酵解基因表達、有氧糖酵解以及腫瘤生長
miR-548a-3p/SIX1軸在乳腺癌中的臨床相關性
對乳腺癌患者標本進行檢測以及數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-548a-3p表達與SIX1基因表達負相關、與PGK1、LDHA等糖酵解基因也成負相關，SIX1與糖酵解基因表達成正相關（圖9A）。SIX1被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中有過表達，比如：超過50%的乳腺癌患者、超過60%的肝癌患者中SIX1高表達。但是miR-548a-3p表達在臨床腫瘤中的情況尚不清楚。此研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌腫瘤組織中miR-548a-3p是顯著下調(diào)的，與腫瘤體積、淋巴結(jié)狀態(tài)、腫瘤分級成負相關。另外，miR-548a-3p表達高的患者預后比較好。（圖9B-C）
圖9. miR-548a-3p/SIX1軸在乳腺癌中的臨床相關性
總結(jié)
SIX1是Warburg 效應的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。在缺氧條件下，miR-548a-3p表達被抑制，使下游靶基因SIX1活化，而SIX1通過與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶HBO1和AIB1相互作用，激活一系列糖酵解基因表達，進而影響調(diào)控細胞糖酵解過程，最終促進細胞惡性轉(zhuǎn)化及癌癥發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)為新的抗腫瘤藥物研發(fā)提供了新的靶點與思路。
圖10. miR-548a-3p / SIX1 / HBO1 / AIB1軸在腫瘤生長中的作用模式圖
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