2017年11月13日，Nature Medicine 在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所周斌研究組的科研成果“Enhancing the precision of genetic lineage tracing using dual recombinases ”。該研究將 Dre-rox 重組系統(tǒng)引入到傳統(tǒng)的基于 Cre-loxP 重組系統(tǒng)的遺傳譜系示蹤技術(shù)中，有效地規(guī)避了由于 Cre 表達(dá)的不特異性而導(dǎo)致的非特異性（“異位”）同源重組，實(shí)現(xiàn)了更為精準(zhǔn)的遺傳譜系示蹤，為發(fā)育、干細(xì)胞及再生等領(lǐng)域的深入研究奠定了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。

新的譜系示蹤技術(shù)?DeaLT（Dual-recombinase-activated lineage tracing）

該技術(shù)將 Dre-rox 重組系統(tǒng)與傳統(tǒng)的 Cre-loxP 重組系統(tǒng)結(jié)合起來，Dre-rox 介導(dǎo)的重組反應(yīng)在可能引起 Cre 異位表達(dá)的細(xì)胞中將 Cre 重組酶的識(shí)別位點(diǎn) loxP 切除掉，從而有效地阻止了 Cre-loxP 的異位重組，增加了 Cre-loxP 介導(dǎo)的譜系示蹤結(jié)果的準(zhǔn)確性。

該系統(tǒng)的兩種策略

DeaLT-IR：

DeaLT-IR 策略的報(bào)告基因小鼠上包含的兩個(gè) loxP 位點(diǎn)和兩個(gè) rox 位點(diǎn)以交錯(cuò)形式存在（loxP-rox-loxP-rox）,例如：

該策略適合組成性 Dre 與誘導(dǎo)性 Cre（CreER）相結(jié)合。

DeaLT-NR：

DeaLT-NR 策略報(bào)告基因小鼠上的 loxP 位點(diǎn)和 rox 位點(diǎn)以嵌合的形式存在（rox-loxP-loxP-rox），例如：

該策略適合誘導(dǎo)性 Dre（DerER） 和誘導(dǎo)性 Cre（CerER） 相結(jié)合。

研究背景

遺傳譜系示蹤技術(shù)（Genetic?lineage tracing）

研究所用小鼠模型

雙報(bào)告基因小鼠

• IR（interleaved reporter）：在 Rosa26 位點(diǎn)定點(diǎn)插入 ZsGreen/tdTomato 雙熒光蛋白報(bào)告基因，其中包含以交錯(cuò)形式存在的兩個(gè) loxP 位點(diǎn)和兩個(gè) rox 位點(diǎn)（loxP-rox-loxP-rox）。

• NR（nested reporter）：在 Rosa26 位點(diǎn)定點(diǎn)插入 ZsGreen/tdTomato 雙熒光蛋白報(bào)告基因，其中包含以嵌合的形式存在的兩個(gè) loxP 位點(diǎn)和兩個(gè) rox 位點(diǎn)（rox-loxP-loxP-rox）。

重組酶工具鼠

• CAG-Dre：廣泛表達(dá)的組成性 Dre

• ACTB-Cre：廣泛表達(dá)的組成性 Cre

• Tnni3-Dre：心肌細(xì)胞組成性 Dre

• Kit-CreER：非心肌細(xì)胞誘導(dǎo)性 Cre（主要在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，在少量心肌細(xì)胞中也有表達(dá)）

• Krt19-Dre：膽管上皮細(xì)胞組成性 Dre，在一些肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中也有 Cre 表達(dá)，也叫 CK19-Dre

• Alb-CreER：肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)性 Cre

• Alb-DreER：肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)性 Dre

• Sox9-CreER：膽管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)性 Cre，在一些門靜脈周圍的肝細(xì)胞中也有 Cre 表達(dá)

研究結(jié)果

• 建立 DeaLT-IR 雙報(bào)告基因系統(tǒng)。

圖5. IR1小鼠構(gòu)建及驗(yàn)證結(jié)果。（b）ACTB-Cre 和 CAG-Dre 分別與?Rosa26-loxP-STOP-loxP-tdTomato 或?Rosa26-rox-STOP-rox-tdTomato 交配，子代E9.5天熒光檢測(cè)重組酶活性。（c）IR1構(gòu)建策略示意圖。（d-f）IR1 分別與?ACTB-Cre 或?CAG-Dre 交配后子代熒光表達(dá)結(jié)果示意圖（d）；E19.5天胚胎熒光檢測(cè)結(jié)果（e）；?E19.5天心臟切片自發(fā)熒光檢測(cè)（f）。

• 利用 DeaLT-IR 雙報(bào)告基因系統(tǒng)（Tnni3-Dre × Kit-CreER × IR1 mice），有效阻斷了心肌細(xì)胞中 c-Kit-CreER 介導(dǎo)的重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)非心肌細(xì)胞中 c-Kit+ 干細(xì)胞特異性的遺傳譜系示蹤。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，c-Kit+ 干細(xì)胞在成體心臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)過程中均不會(huì)分化形成心肌細(xì)胞，主要是通過血管新生參與心臟修復(fù)。

圖6. DeaLT-IR 系統(tǒng)揭示 c-Kit+ 非心肌細(xì)胞不會(huì)向心肌細(xì)胞分化。?（a）Tnni3-Dre × Kit-CreER × IR1 小鼠中?Tnni3-Dre 在心肌細(xì)胞中先切除一個(gè) loxP 位點(diǎn)和 ZsGreen，如此一來 tamoxifen 只能誘導(dǎo)非心肌細(xì)胞中 Kit-CreER 的重組，從而標(biāo)記 c-Kit+ 的非心肌細(xì)胞。（b）給予 tamoxifen 誘導(dǎo)熒光標(biāo)記與檢測(cè)及心肌梗死造模時(shí)間軸。（c-e）在未損傷的心臟中，Kit-CreER×IR1 小鼠除了大量 ZsGreen 綠色熒光蛋白標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞以外，還可觀察到一些綠色熒光標(biāo)記的心肌細(xì)胞；而利用 DeaLT-IR 系統(tǒng)，則沒有心肌細(xì)胞被 ZsGreen 綠色熒光標(biāo)記。說明 c-Kit+ 非心肌細(xì)胞并未生成新的心肌細(xì)胞。（f-k）相似的，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎導(dǎo)致心肌梗死模型4周后，在受損的心臟中，Kit-CreER×IR1 的常規(guī)示蹤策略可觀察到一些綠色熒光標(biāo)記的心肌細(xì)胞；而 DeaLT-IR 系統(tǒng)中則沒有心肌細(xì)胞被 ZsGreen 綠色熒光標(biāo)記。說明 c-Kit+ 非心肌細(xì)胞在心臟受損情況下同樣未形成新的心肌細(xì)胞。（l-m）而內(nèi)皮細(xì)胞在常規(guī)示蹤方法及新的示蹤系統(tǒng)中均可被標(biāo)記。

• DeaLT-IR 系統(tǒng)也可追蹤細(xì)胞轉(zhuǎn)化。比如清楚地展現(xiàn)肝損傷后肝細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)分化形成膽管上皮細(xì)胞的過程。

圖7. 利用肝細(xì)胞向膽管細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程進(jìn)一步驗(yàn)證?DeaLT-IR 系統(tǒng)。（a）在 Krt19-Dre×Alb-CreER×IR1 小鼠中，CK19+ 膽管上皮細(xì)胞（BECs）表達(dá) tdTomato 紅色熒光蛋白，而 肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞則被 ZsGreen 綠色熒光蛋白標(biāo)記。（b-d）DDC 誘導(dǎo)肝損傷后，大量纖維組織形成，并發(fā)生導(dǎo)管反應(yīng)。（e-g）DDC 誘導(dǎo)前，Alb-CreER 使大多數(shù)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞被標(biāo)記綠色熒光，但并沒有標(biāo)記膽管上皮細(xì)胞。DDC 誘導(dǎo)肝損傷后，有一部分 CK19+ BECs 表達(dá) ZsGreen 綠色熒光蛋白。傳統(tǒng)示蹤方法與新系統(tǒng)均得到同樣的結(jié)果。（h）肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞向?qū)Ч苌掀ぜ?xì)胞轉(zhuǎn)化的示意圖。

• 建立 DeaLT-NR 雙報(bào)告基因系統(tǒng)。

圖8. NR1 小鼠構(gòu)建及驗(yàn)證結(jié)果。（a）NR1 小鼠構(gòu)建策略示意圖。（b）DeaLT-NR 系統(tǒng)（A-Cre×B-Dre×NR1）原理示意圖。A+ 細(xì)胞被標(biāo)記上綠色熒光，B+ 細(xì)胞被紅色熒光標(biāo)記，A+B+ 細(xì)胞標(biāo)記紅色熒光。（c）CAG-Dre 和 ACTB-Cre 分別與 NR1 小鼠交配示意圖。（d-e）E13.5天，CAG-Dre 和 ACTB-Cre 分別與 NR1 小鼠交配子代熒光表達(dá)檢測(cè)。

• 利用 DeaLT-NR?雙報(bào)告基因系統(tǒng)（Alb-DreER × Sox9-CreER × NR1 mice），有效阻斷了 Sox9-CreER 在肝細(xì)胞中的重組反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了Sox9+ 膽管上皮細(xì)胞中特異性的遺傳譜系示蹤，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肝臟生理穩(wěn)態(tài)和損傷修復(fù)過程中 Sox9+ 膽管上皮細(xì)胞并不會(huì)轉(zhuǎn)分化形成肝細(xì)胞。

圖9. DeaLT-NR 系統(tǒng)揭示肝臟損傷后 Sox9+ 膽管上皮細(xì)胞向膽管細(xì)胞而非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞分化。（a）DeaLT-NR 系統(tǒng)記、CCl4肝損傷造模及檢測(cè)時(shí)間軸。（b-c）Alb-DreER×Sox9-CreER×NR1 小鼠中 Cre 及 Dre 介導(dǎo)的重組效果示意圖。在 DeaLT-NR 系統(tǒng)中 Sox9+ BECs 被標(biāo)記為綠色（ZsGreen），而 Sox9+ 門靜脈周圍肝細(xì)胞則被標(biāo)記為紅色（tdTomato）。（d-f）利用 DeaLT-NR 系統(tǒng)，可以排除由于 Sox9 在 HNF4a+ 門靜脈周圍肝細(xì)胞中少量表達(dá)導(dǎo)致的綠色熒光標(biāo)記；并且在 CCl4 誘導(dǎo)慢性肝損傷后，沒有觀察到綠色熒光細(xì)胞數(shù)量的增加。（g-h）示意圖說明傳統(tǒng)示蹤方法中觀察到的肝損傷后綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞的增加其實(shí)是少量 Sox9+ 門靜脈周圍肝細(xì)胞的增加；而非 Sox9+ 膽管上皮細(xì)胞向肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。

• DeaLT 系統(tǒng)可以嚴(yán)格控制潛在的非靶向細(xì)胞表達(dá)Cre介導(dǎo)的異位譜系追蹤，為更準(zhǔn)確地解析細(xì)胞起源和命運(yùn)提供了有效的手段。

圖10. DeaLT 系統(tǒng)解決異位譜系示蹤難題。（a）將 Dre-rox 系統(tǒng)引入到常規(guī)的 Cre-loxP 介導(dǎo)的譜系示蹤系統(tǒng)中，增加了系統(tǒng)的精準(zhǔn)性，嚴(yán)格控制了 Cre 的異位表達(dá)。（b）DeaLT 系統(tǒng)準(zhǔn)確性示意圖。

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