2017年9月15日，Cell Research 在線發(fā)表了中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所童明漢研究組的研究成果 “Mettl3/Mettl14-mediated mRNA N6-methyladenosine modulates murine spermatogenesis”。該研究繪制了小鼠不同發(fā)育階段生精細(xì)胞的 m6A RNA 修飾圖譜，揭示了 m6A RNA 修飾通過調(diào)控精子發(fā)生過程中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄后翻譯，從而控制精子發(fā)生的分子機(jī)制。

研究背景

精子發(fā)生是一個(gè)高度復(fù)雜和特化的細(xì)胞發(fā)育過程，包括精原細(xì)胞增殖、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成三個(gè)階段。精子發(fā)生過程中的基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平及翻譯水平上受到精密的調(diào)控，從而確保精子發(fā)生不同階段功能特異基因的準(zhǔn)確表達(dá)。例如，在長形精子階段，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄停止；其功能所需的 mRNA 在精母細(xì)胞或圓形精子階段就已經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成，而一直處于翻譯抑制狀態(tài)，直到長形精子階段再被翻譯激活。因此，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及翻譯調(diào)控在這一過程中發(fā)揮著尤為重要作用。?

m6A（N6-甲基腺嘌呤，N6-methyladenosine）是最常見、最豐富的真核生物 mRNA 轉(zhuǎn)錄后修飾形式之一。參與調(diào)節(jié) RNA-蛋白相互作用，RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，RNA 剪接，翻譯調(diào)控及 RNA 分子穩(wěn)定性調(diào)控等等。它是在 RNA 分子的A堿基第六位的 N 元素上加上一個(gè)甲基基團(tuán)的修飾方式。該修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)可逆的過程，由“書寫器”甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（METTL3，METTL14，WTAP 組成）、“擦除器”去甲基酶（FTO 和 ALKBH5）以及相應(yīng)的“閱讀器”（YTHDF 或 YTHDC 等）協(xié)同調(diào)控。m6A 的生物學(xué)功能已備受關(guān)注，并成為生命科學(xué)熱門研究領(lǐng)域之一。

Fig1. m6A“書寫器”與“擦除器“ （圖片來自 Nat Rev Mol Cell Biol, 2014. 15(5): p. 313-26.）

為了研究 m6A RNA 修飾在精子發(fā)生不同時(shí)期的作用，研究人員運(yùn)用條件性基因敲除小鼠模型，利用不同發(fā)育階段的精細(xì)胞 marker gene promoter 驅(qū)動(dòng)的 Cre 工具鼠（精子發(fā)生早期就開始表達(dá)的 Vasa 基因、以及精子發(fā)育后期表達(dá)的 Stra8 基因），分別在早期及后期生精細(xì)胞中，特異性敲除 m6A RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Mettl3 和/或 Mettl14）。

研究中所用小鼠模型

• Mettl3 flox 小鼠： 兩個(gè)同向 loxp 位點(diǎn)分別位于 m6A ”書寫器“? Mettl3 基因 intron3 和 intron4 中，flox exon4。

• Mettl14 flox 小鼠： 兩個(gè)同向 loxp 位點(diǎn)分別位于 m6A ”書寫器“ Mettl14 基因 intron1 和 intron2 中，flox exon2。

• Vasa-Cre 工具鼠：也叫 Ddx4-Cre，生殖細(xì)胞特異性 Cre ，在胚胎期第15天-第18天開始表達(dá) Cre，可在早期生精細(xì)胞（gonocyte）中敲除 floxed 基因。

• Stra8-GFPCre 工具鼠： 利用 Crispr-Cas9 技術(shù)，將 2A-GFPCre 融合 cDNA 插入到小鼠 Stra8 基因終止密碼子前，獲得既表達(dá)內(nèi)源 Stra8 又表達(dá) GFPCre 的工具鼠品系?？稍诤笃谏?xì)胞——A1型精原細(xì)胞（type A1 spermatogonia，減數(shù)分裂之前）表達(dá) Cre。（南模生物構(gòu)建）

研究結(jié)果

• 在早期生精細(xì)胞（gonocyte）內(nèi)，只要敲除 Mettl3 或 Mettl14，均可導(dǎo)致精原干細(xì)胞丟失。

Fig2.? 早期生殖細(xì)胞特異性敲除 Mettl3-vKO（左圖） 或 Mettl14-vKO（右圖）。(A) UPLC-MS/MS (超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法) 分析 Mettl3 或 Mettl14 敲除后未分化精原細(xì)胞中 m6A 修飾的比例顯著降低。 (B) Mettl3 或 Mettl14 敲除后小鼠睪丸形態(tài)改變。 (C-D) H-E 切片染色，觀察6周齡小鼠睪丸形態(tài)。 (E-F) 6周齡小鼠睪丸切片免疫熒光染色，綠色為生殖細(xì)胞 marker GCNA，紅色為支持細(xì)胞 marker SOX9，藍(lán)色為細(xì)胞核 DAPI。(G-H) 4周齡小鼠細(xì)精管切片免疫熒光染色，綠色為早期未分化精原細(xì)胞 marker GFRa1，紅色為分化精原細(xì)胞 marker PLZF，藍(lán)色為細(xì)胞核 DAPI；白色箭頭指示 GFRa1 陽性細(xì)胞，表示As精原細(xì)胞，黃色箭頭指示 PLZF 陽性細(xì)胞，表示Ap精原細(xì)胞。

• 在相對(duì)后期生精細(xì)胞（type A1 spermatogonia）內(nèi)，只有同時(shí)敲除 Mettl3 和Mettl14，才能夠?qū)е戮有纬烧系K。

Fig3.? 后期生精細(xì)胞中 Mettl3 和 Mettl14 雙基因敲除 (Mettls-sKO) 的表型。(A) UPLC-MS/MS 分析 m6A 比例：單敲除 Mettl3-sKO 或 Mettl14-sKO 后，線期精母細(xì)胞中 m6A 水平降低大約55%-65%；而 Mettls-sKO 兩個(gè)基因同時(shí)敲除后 m6A 水平進(jìn)一步顯著下降至20%以下。(B) 雙基因敲除后，睪丸與附睪形態(tài)改變：精子數(shù)量顯著減少。(C) 雙基因敲除后，2月齡小鼠附睪尾部精子數(shù)量僅為對(duì)照組的2%。計(jì)算機(jī)輔助精子分析（Computer Assisted Sperm Analysis, CASA）顯示雙基因敲除后精子活力也嚴(yán)重受損。(D) 熒光染色表明超過80%的附睪尾部精子頭部發(fā)生異常。 花生植物凝血素（PNA，紅色）顯示頂體，MitoTracker 線粒體綠色熒光染料（綠色）顯示線粒體，DAPI（藍(lán)色）顯示細(xì)胞核。

• 應(yīng)用 m6A-seq 繪制了精子發(fā)生不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞 m6A RNA修飾動(dòng)態(tài)變化圖譜，提示 m6A RNA修飾水平影響轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。

Fig4.??精子發(fā)生過程中 m6A? 的動(dòng)態(tài)變化。(A) 精原細(xì)胞在6個(gè)不同發(fā)育階段中 m6A 的定量分析。Un.S：未分化精原細(xì)胞；A1：A1型精原細(xì)胞；Prel：前細(xì)線期精母細(xì)胞；L/Z：細(xì)線/偶線期精母細(xì)胞；Pa：粗線/雙線期精母細(xì)胞；Spd：圓形精細(xì)胞。(B)? m6A-seq分析不同發(fā)育階段的? m6A 讀取密度。(C) 不同發(fā)育階段中當(dāng) m6A 水平上升時(shí)（上圖）以及下降時(shí)（下圖）甲基化基因（黑）RNA 表達(dá)水平均高于未甲基化（紅）基因。

• 失活 m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶后，其介導(dǎo)的 m6A RNA 修飾水平顯著降低，導(dǎo)致調(diào)控精原干細(xì)胞命運(yùn)決定和精子形成的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄后翻譯效率顯著變化。
  

Fig5.?? RNA-Seq 以及 Ribosome profiling 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn) Mettl3-vKO 和 Mettl14-vKO 單基因敲除小鼠 THY1+ SSC/前體細(xì)胞 mRNA 翻譯失調(diào)。

Fig6.??? Mettl3 和 Mettl14 雙基因敲除小鼠（Mettls-sKO）精子細(xì)胞 mRNA 翻譯失調(diào)。

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